維生素D 受體基因多態(tài)性與6 月齡嬰兒骨密度關(guān)系分析

陳葉 王波倫 張愛(ài)君

（南京市雨花臺(tái)區(qū)婦幼保健所 江蘇 南京 210000）

目前維生素D 基因多態(tài)性與鈣缺乏相關(guān)的研究較多，但具體的基因位點(diǎn)尚有爭(zhēng)論，且針對(duì)嬰幼兒的研究較少，而嬰幼兒又是鈣缺乏的高發(fā)人群，可導(dǎo)致活動(dòng)性佝僂病，低鈣驚厥、生長(zhǎng)遲緩、萎靡、易激惹、易發(fā)生呼吸道感染等。本研究從嬰兒入手，研究維生素D 基因多態(tài)性與鈣缺乏的關(guān)系，為兒童的營(yíng)養(yǎng)保健指導(dǎo)提供依據(jù)。

1.資料和方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2016 年1—6 月在南京市雨花臺(tái)區(qū)婦幼保健所進(jìn)行系統(tǒng)管理的6 月齡嬰兒115 例(其中女?huà)?6 例，男嬰59 例)，均無(wú)服用骨代謝藥物，無(wú)影響骨代謝的遺傳、代謝疾病史者。

1.2 方法

1.2.1 體格檢查 身長(zhǎng)、體重：穿單衣單褲，脫鞋襪，扣除尿不濕等重量，連測(cè)3 次取平均值并計(jì)算BMI。

1.2.2 25(OH)D3檢測(cè) 常規(guī)采末梢血，統(tǒng)一采用英國(guó)IDS 公司試劑盒檢測(cè)25(OH)D3濃度。

1.2.3 BMD 測(cè)定 使用以色列Sunlight 公司Ominisense7000P型檢測(cè)儀進(jìn)行骨密度測(cè)量。以嬰兒左側(cè)脛骨中段為測(cè)量點(diǎn)，測(cè)量Z 值。

1.2.4 VDR 等位基因測(cè)定(收集口腔黏膜細(xì)胞，郵寄至上海解碼DNA 公司檢測(cè))PCR 反應(yīng)步驟：基因組DNA 200ng、Dntp 200umol/L、MgCl21.5mmol/L、引物0.5umol/L、Taq plus(Taq+Pfu)DNA 聚合酶2.5U 和1×Taq plus DNA 聚合酶緩沖液，加水至終體積50uL；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min 之后，95℃變性40s，分別68℃、58℃、60℃退火40s，72℃延伸40s，循環(huán)30 圈，最后72℃延伸7min。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。分別用限制性?xún)?nèi)切酶ApaI、BsmI、FokI 進(jìn)行酶切。ApaI、BsmI 酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖膠電泳，F(xiàn)okI 酶切產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳。于ZF-A2 型紫外透射分析儀下觀察酶切結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（±s）表示；兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組間對(duì)比采用多元素協(xié)方差分析，用Levene 檢驗(yàn)檢測(cè)誤差方差齊性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)采取α=0.05（雙側(cè)），P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 一般數(shù)據(jù)

59 例男嬰平均身長(zhǎng)(68.50±1.67)cm、體重(8.47±0.78)kg、BMI（18.07±1.56）kg/m2、骨密度Z 值（-0.56±1.12）、25(OH)D3（66.01±12.01）μmol/L；56 例 女 嬰 平 均 身 長(zhǎng)（67.60±1.80）cm、體重（8.04±0.82）kg、BMI（17.58±1.68）kg/m2、骨密度Z 值（-0.68±1.12）、25(OH)D3（65.14±13.84）μmol/L；使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，男嬰身長(zhǎng)高于女?huà)搿Ⅲw重重于女?huà)耄町愶@著（P=0.009、0.005），而B(niǎo)MI、骨密度、25(OH)D3男女之間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

2.2 VDR 基因型分布頻率見(jiàn)表1。

表1 115 例 VDR 基因型分布頻率

2.3 VDR 基因多態(tài)性與BMD 的關(guān)系

用多因素協(xié)方差分析，去除維生素D 攝入量、戶(hù)外活動(dòng)時(shí)間、體重等混雜因素，以25(OH)D3、BMI 為協(xié)變量，以VDR 基因型為自變量，以BMD Z 值為因變量進(jìn)行分析,Levene 檢驗(yàn)顯示ApaI、BsmI、FokISig 值分別為0.203、0.220、0.440，均大于0.05，顯示總的方差齊，可使用多因素協(xié)方差分析法。不同基因型分析顯示FokI 不同基因型間F 值為5.15，sig 值為0.007，P ＜0.05,不同基因型之間BMD 有顯著差異，而ApaI、BsmI 不同基因型之間BMD 無(wú)顯著差異，見(jiàn)表2。

表2 VDR 基因多態(tài)性與BMD 的關(guān)系

3.討論

維生素D 是一種特殊的維生素，有類(lèi)固醇激素作用，在肝臟和腎臟羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為活性形式25(OH)D3，再與維生素D 受體結(jié)合，發(fā)揮鈣、磷調(diào)節(jié)等生物學(xué)作用。而在嬰幼兒期，維生素D 更為重要，不足或缺乏，不僅導(dǎo)致佝僂病，而且與哮喘、超重或肥胖等疾病密切相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)嬰兒25(OH)D3缺乏、不足的比率分別為13.91%、60.00%，與繆美華等報(bào)道[1]的學(xué)齡前兒童25(OH)D3缺乏、不足的比率42.37%、40.38%比較，缺乏率降低，不足率升高，其余正常比率亦升高，推測(cè)原因除了年齡、季節(jié)因素影響外，與近年來(lái)公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，提高了嬰幼兒定期健康體檢率，提高了營(yíng)養(yǎng)性維生素D 缺乏的早期發(fā)現(xiàn)率、糾正率有關(guān)。

VDR 基因存在于第12 號(hào)染色體上，由多個(gè)外顯子及數(shù)個(gè)內(nèi)含子組成，屬于核受體超家族，在人體廣泛存在，只要是有核細(xì)胞均能表達(dá)。VDR 基因的某一個(gè)堿基突變有一定的分布頻率，稱(chēng)為單核苷酸多態(tài)性，ApaI、BsmI、FokI 為幾個(gè)主要的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。本研究所得的基因頻率ApaI A(26.96%)、a(73.04%)；BsmI B(6.52%)、b(93.48%);FokI F(56.09%)、f(43.91%)與既往國(guó)內(nèi)研究漢族人群相近[2]，與維吾爾族、巴西種族人群基因頻率差別較大[2-4]，顯示了人種的差異在VDR 基因多態(tài)性上的不同表達(dá)。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于VDR 基因多態(tài)性與骨密度、骨質(zhì)疏松、佝僂病等骨骼系統(tǒng)關(guān)系的研究未得出一致結(jié)論[5-6]。本次研究通過(guò)多元素協(xié)方差分析，發(fā)現(xiàn)FokI 基因多態(tài)性與骨密度相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)ApaI、BsmI 基因多態(tài)性與骨密度相關(guān)。FokI 基因多態(tài)性中FF 等位基因者骨密度高于ff 等位基因者，與西安于偉利等[7]一致。而印度Kajale 等[8]研究則未得出FokI 基因多態(tài)性與骨密度相關(guān)結(jié)論。推測(cè)與影響骨密度的因素較多：人種、遺傳、日照時(shí)間、維生素D 攝入量、鈣攝入量、體重、維生素D 與鈣吸收率、生長(zhǎng)激素、甲狀旁腺激素、降鈣素等。

維生素D 受體基因多態(tài)性與骨代謝密切相關(guān)已得到了明確的認(rèn)識(shí)，而基因位點(diǎn)與嬰幼兒鈣缺乏及佝僂病的關(guān)系和作用機(jī)制需進(jìn)一步研究，以便于更好地指導(dǎo)嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)保健，促進(jìn)兒童骨骼健康。