ＩＬ－１對病理性瘢痕成纖維細胞超微結構的影響

楊東元　羅錦輝等

(第一軍醫大學南方醫院整形外科廣州510515)

楊東元男,1967年生。1991年畢業于第四軍醫大學軍醫系,1996年畢業于第一軍醫大學,獲外科學醫學碩士學位,現工作于南方醫院整形外科。參加兩項國家自然科學基金項目和一項國家衛生部電教教材制作項目;發表于國家一類雜志論文6篇。[摘要]目的:闡明白細胞介素-1對病理性瘢痕效應的作用機理。方法:觀察白細胞介素-1對病理性瘢痕成纖維細胞超微結構的影響。結果:該介素明顯破壞了線粒體、粗面內質網、核糖體等重要細胞器。結論:證明白細胞介素-1是成纖維細胞合成膠原的負性調節因子。

[關鍵詞]白細胞介素-1病理性瘢痕成纖維細胞超微結構

[中圖分類號]R322.99[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2000)05-0324-02

THE EFFECTS OF INTERLEUKIN-1 ON THE ULTRASTRUCTURE

OF CULTURED FIBROBLASTS FROM PATHOLOGICAL SCAR

YANG Dong-yuanLUO Jin-huiGAO Jian-huaZHANG et al.

The Plastic Surgery Department of Nanfang Hospital,The First Military

Medical University(Guangzhou 510515)

[Abstract]Objective:To investigate the effects of interleukin-1 on the ultrastructure of cultured fibroblasts from pathological scar.Methods:Transmission election microscope were used to observe the ultrastructure of FB.Results:After treatment with IL-1,the main cell organs,including rough endoplasmic reticular,mitochondrid and ribosome,were destroyed.Conclusion:IL-1 is a negative regulator in collagen synthesis of fibroblasts.It could be used for the treatment and the prevention of pathologic scar.

[Key words]Interleukin-1UltrastructureFibroblastPathological scar

細胞因子介導的免疫應答在病理性瘢痕的形成中起著調控作用^[1],部分學者認為其中的白細胞介素-1(Interleukin-1簡稱IL-1)為膠原合成的負性調節因子,能刺激瘢痕成纖維細胞內膠原酶的合成^[2],抑制前膠原蛋白的合成^[3],但也有不同的見解。我們以體外二維培養的病理性瘢痕成纖維細胞為實驗對象,研究了白細胞介素-1對其超微結構的影響,探討白細胞介素-1對病理性瘢痕效應的作用機理,為臨床應用它治療病理性瘢痕提供理論依據。

1材料與方法

1.1試劑與材料本實驗所用增殖性瘢痕或瘢痕疙瘩標本均取自第一軍醫大學南方醫院整形外科病人;白細胞介素-1(北京北方同正生物技術發展公司)、DMEM培養基干粉(美國GIBCO公司)、L-谷氨酰胺(中國科學院上海生物化學研究所)、新生小牛血清(超級;杭州四季青生物工程研究所)、HEPES(香港FARCO公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)

1.2成纖維細胞的體外二維培養

1.2.1原代培養將手術切除的瘢痕組織,在無菌條件下剪成0.5cm³～1.0cm³的小塊,立即投入含100U/ml青、鏈霉素的培養液中。剪除脂肪、表皮及結締組織,D-Hanks液清洗至無油滴,反復剪碎至小于1mm³的小塊,同時加數滴血清,按適當間隔接種于培養瓶壁上,反轉使有組織塊的一面向上,加入含20%FBS的DMEM培養基3ml,置37℃、95%空氣、5%CO²、飽和濕度6～8小時后,輕輕倒轉,使培養液浸沒組織塊,待培養液變黃后更換。4～10天組織塊周圍萌出細胞并逐漸形成細胞暈,20～30天細胞長滿瓶,形成細胞單層。

1.2.2傳代培養加入0.25%胰蛋白酶消化約0.5min,細胞收縮變圓后棄去胰酶,加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化并輕輕吹打,形成細胞懸液。按1∶3比例傳代,建立病理性瘢痕成纖維細胞的傳代細胞系,實驗用第4～15代細胞。

1.2.3白細胞介素-1對成纖維細胞的處理將5000個/ml的細胞懸液,分別加入24孔培養板各孔中,貼壁后均棄上清。前8孔為實驗組1,加入含IL-1 100U/ml的條件培養基;中間8孔為實驗組2,加入含IL-1 200U/ml的條件培養基;后8孔為對照組,加入普通培養基。24小時后消化成細胞懸液分別收集。

1.2.4成纖維細胞電鏡樣品的制備將各組懸液分別轉入離心管中的瓊脂管內,以800R/min低速離心10min;棄上清,各加入2.5%戊二醛0.5ml,室溫固定5小時,棄上清,燒熱的玻棒輕劃瓊脂管內壁,使融化的瓊脂流下,包埋住管底的細胞團;用特制的薄鐵片將瓊脂管剝離出;切除多余的瓊脂,形成細胞瓊脂凝膠包埋塊,將包埋塊切成1mm³的小塊,置1%四氧化鋨中固定1.5小時,常規脫水、浸透、包埋、超薄切片、鈾鉛染色,透射電子顯微鏡(TEM)觀察。

2結果ザ哉兆橄赴漿內具有豐富的粗面內質網和線粒體,內質網呈密集小管狀,平行排列;線粒體較多,呈卵圓形,具有環形嵴;還可見溶酶體等結構。細胞核呈圓形或卵圓形,核質均勻細致,核仁清晰呈網狀。ナ笛樽1細胞有不同程度的損傷,胞漿內出現較多較大的空泡,線粒體腫脹或消失;粗面內質網明顯擴張,數量減少。實驗組2線粒體環形嵴退化、變形或消失;粗面內質網裂解、空泡化;粗面內質網表面核糖體解聚、脫落;細胞膜和細胞核仍保持其完整性。

3討論ゲ±硇擇：凼且越涸等大量細胞外基質過度產生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病^[4],是美容整形外科的主要難題。成纖維細胞攝取合成蛋白所需的脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸等,在粗面內質網的核糖體上按照特定的膠原mRNA信息排列,合成前α多肽鏈。后者邊合成邊進入粗面內質網內,經羥化酶羥化,三條前α多肽鏈互相擰成繩索狀的前膠原蛋白分子,再轉移到高爾基復合體中加上糖基,經胞吐方式分泌到細胞間質。線粒體是細胞進行生物氧化及提供生命活動所需能量的場所,三羧酸循環、呼吸鏈電子傳遞及氧化磷酸化都在線粒體內進行,線粒體、內質網和核糖體超微結構的變化對成纖維細胞合成膠原蛋白的功能具有重要的意義。本研究透射電鏡顯示,實驗組細胞超微結構形態有明顯變化,表現為粗面內質網擴張、囊泡化;線粒體腫脹、空泡化;核糖體脫顆粒、解聚;其它細胞器均有不同程度的破壞,并與用藥劑量呈正相關。這說明白細胞介素-1是通過破壞前膠原蛋白合成的場所-粗面內質網和核糖體及細胞活動的能量中心-線粒體來抑制瘢痕成纖維細胞前膠原蛋白的生成,即白細胞介素-1為膠原合成的負性調節因子。這一結果與我們從定量免疫細胞化學角度研究白介-1對瘢痕成纖維細胞內前膠原蛋白影響的結論相吻合^[5]。プ凵纖述,白細胞介素-1通過對前膠原蛋白合成的負性調節抑制了膠原的生成,該作用至少發生于翻譯水平,這一結果為臨床應用白細胞介素-1防治病理性瘢痕提供了一定的理論依據。

[參考文獻]

1Zhang K,Carner W,Cohen L et al.Increased type I and Ⅲ collagen and transforming growth factor-β1 mRNA and protein in hypertrophic burn scar.J Invest Dermatol,1995;104:750

2Arhold E.Interleukin-1 stimulation of collagenase production by cultured fibroblast.Journal of Experimental Medicine,1983;157:801

3R.Bhatnagar.Interleukin-1 inhibits the synthesis of collagen by fibroblasts[J].Biochemistry International,1986;13:709

4Reckwell WB,Cohen IK.Keloids and hypertrophic scars:a comprehensive review[J].Plast Reconstr Surg,1989;84:827

5楊東元,羅錦輝.白細胞介-1對病理性瘢痕成纖維細胞膠原合成的影響[J].中華整形燒傷外科雜志,1999;15:434。

收稿日期2000-05-09

編輯/樊延南