平菇菌絲體多糖的分離純化和體外抗氧化活性

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，婁 虹，霍雅鵬

(遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

平菇菌絲體多糖的分離純化和體外抗氧化活性

曹向宇，劉劍利*，蘆秀麗，婁 虹，霍雅鵬

(遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

采用酶法提取平菇菌絲體多糖，通過L9(34)正交試驗考察加酶量、溫度、時間、pH值對平菇菌絲體多糖提取率的影響，確定其最佳提取條件；通過DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾純化平菇菌絲體多糖，DPPH自由基清除作用測定抗氧化活性，紫外光譜掃描和薄膜電泳方法鑒定多糖的純度；利用化學比色法檢測其對O2－·和·OH的清除能力和對小鼠紅細胞溶血抑制程度。結果表明：平菇菌絲體多糖最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時間2h、pH5.3，最佳條件下多糖提取率為(4.91±0.15)%；純化后的多糖能清除O2－·和·OH及抑制紅細胞溶血的生成，且呈現一定劑量關系。表明平菇菌絲體多糖在一定濃度范圍內具有體外抗氧化作用。

平菇菌絲體；多糖；純化；抗氧化

Abstract：Crude polysaccharides were extracted fromPleurotus ostreatusmycelium by cellulase. Optimal extraction conditions were explored to evaluate the effects of enzyme dosage, extraction temperature, extraction time and pH on extraction rate of polysaccharides through orthogonal experiments. Crude polysaccharides were purified with DEAE-32 and Sephadex G100 column chromatography. The purity of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium was determined by UV scanning and cellulose acetate electrophoresis. Antioxidant activity of polysccharides was evaluated by the scavenging capability of surperoxide anion and hydroxyl free radicals and the inhibition rate of erythrocyte hemolysis. Results indicated that the optimal extraction conditions for preparing polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium by cellulase were enzyme dosage of 1.0%,extraction temperature of 55 ℃, extraction time of 2 h and pH 5.3. The extraction rate was up to (4.91±0.15)% under the optimal extraction conditions. The purified polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium revealed antioxidant activity such as scavenging capability of free radicals and suppression of erythrocyte hemolysis in a dosage-dependent manner. Therefore, the polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium have strong antioxidant activity in vitro in a certain concentration range.

Key words：Pleurotus ostreatusmycelium；polysaccharides；purification；antioxidation

平菇(Pleurotus ostreatus)又名側耳、蠔菇、黑牡丹菇、秀珍菇，屬于擔子菌門、傘菌目、側耳科，是目前我國栽培廣泛的食用菌之一。平菇含豐富的碳水化合物、蛋白質、膳食纖維、維生素、礦物質等營養物質，具有增強機體免疫功能，改善人體的新陳代謝，調節植物神經，減少血清膽固醇、降低血壓和防治肝炎、胃潰瘍等功效[1]。

近年來，開發與利用真菌多糖作為保健食品和藥品已逐漸為人們所認識。真菌多糖不僅具有抗氧化、抗病毒、抑菌、抗腫瘤和提高機體免疫力等多種生物活性，而且具有良好的藥理和臨床利用價值[2-6]。目前食藥用真菌多糖主要是從子實體中獲得，但子實體栽培周期長，勞動強度大，受氣候、環境的影響嚴重，而菌絲體具有生長速度快，發酵步驟簡單、產量大、易于控制等優點，從菌絲體中提取多糖可以縮短生產時間、提高生產效率，便于大規模工業化生產。目前國內對平菇研究主要集中于在選育、栽培和增產方面[7-10]，子實體多糖提取也有研究[11-12]，但平菇菌絲體多糖提取、純化及生物活性研究未見報道。本研究即以平菇菌絲體為原料，優化平菇菌絲體多糖的提取方法，對菌絲體多糖進行純化和抗氧化活性分析，以期為平菇資源的進一步研究與開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平菇(Pleurotus ostreatus)菌種(北平11) 遼寧大學生命科學院保藏；昆明種小鼠 中國醫科大學實驗動物中心；氯化硝基四氮唑藍(NBT) 前進化學試劑廠；核黃素 上海和逸化工有限公司；纖維素酶(6萬U/g)、二苯基苦味肼基(DPPH)、Sephadex G100 Sigma公司；DEAE-32纖維素 Whatman公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SCR 20BC型高速冷凍離心機 日本日立公司；UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DYY-5型電泳儀 北京六一儀器廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體多糖提取工藝流程

菌種→菌種活化→搖瓶培養→離心(3000r/min，10min)收集沉淀→菌絲體→烘干→粉碎→過篩(80目)→酶法提取多糖→離心→上清液得到粗多糖溶液→乙醇沉淀多糖→Sevag法除蛋白→硫酸-蒽酮法測多糖含量→離子交換層析→凝膠過濾→純度鑒定→抗氧化活性分析

1.3.2 菌種活化和搖瓶培養[7]

1.3.2.1 菌種活化

將平菇菌種轉接在PDA斜面培養基上，于25℃生化培養箱中培養6d。

1.3.2.2 一級搖瓶培養

可溶性淀粉培養基，裝液量150/500mL，高壓常規滅菌后，每瓶接種約1cm2的活化菌種3塊，置于25℃恒溫培養箱中靜止培養24h后，置于25℃，以160r/min恒溫振蕩培養箱中培養6d。

1.3.2.3 二級搖瓶培養

二級搖瓶培養基，裝液量200/500mL，接種量8%，160r/min，25℃搖床振蕩培養6d。

1.3.3 平菇菌絲體多糖提取優化實驗[13]

根據表1，以料液比1:60加水后進行平菇菌絲體多糖提取的正交試驗L9(34)，優化平菇菌絲體多糖提取條件，其中，料液比(g/g)＝菌絲體干質量/水質量。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

1.3.4 多糖含量測定及多糖提取率計算

硫酸-蒽酮比色法測定多糖含量[14]。

1.3.5 平菇菌絲體多糖純化

1.3.5.1 DEAE-32離子交換層析純化多糖

將正交試驗制備的粗多糖(質量濃度達到50mg/mL)溶解后進行DEAE-32離子交換柱(2.6cm×50cm)層析純化粗多糖，上樣體積8mL，以0～1.0mol/L NaCl梯度洗脫(2mL/管)，硫酸-蒽酮法檢測多糖，收集單一峰，蒸餾水透析48h，冷凍干燥，檢測各組分對DPPH自由基的清除作用，鑒定各峰抗氧化活性[15]。

1.3.5.2 Sephadex G100凝膠過濾純化多糖

DEAE-32離子交換層析純化后收集具有較高抗氧化活性的單一峰(多糖質量濃度20mg/mL)，進一步分離純化，Sephadex G100凝膠過濾(2.6cm×70cm)[15]，上樣體積1mL，蒸餾水洗脫(2mL/管)，硫酸-蒽酮法檢測多糖，收集單一峰，蒸餾水透析48h，冷凍干燥，檢測各組分對DPPH自由基的清除作用，鑒定各峰抗氧化活性[16]。

1.3.6 平菇菌絲體多糖純度鑒定

1.3.6.1 紫外光譜掃描[17]

經層析分離后的多糖，在200～350nm波段進行紫外光譜掃描。

1.3.6.2 醋酸纖維素薄膜法[18]

收集經層析分離后的多糖，將醋酸纖維素薄膜在巴比妥緩沖液中浸泡1h，濾紙吸干液體，點樣后在20V電泳30min。電泳后用甲苯胺藍染液染色，0.5%的冰醋酸溶液脫色，結果照相分析。

1.3.7 平菇菌絲體多糖體外抗氧化活性實驗[19]

大量收集DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾分離純化后的對DPPH自由基清除率最高的平菇菌絲體多糖，進行體外抗氧化活性實驗研究。

1.3.7.1 清除自由基能力測定

配制0.1～0.5mg/mL不同質量濃度的多糖溶液，NBT法測定清除能力[20]；脫氧核糖法測定清除·OH能力[21]，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3.7.2 H2O2誘導的紅細胞氧化溶血實驗

依文獻[22]方法操作，制備0.5%紅細胞懸液，配制0.1～0.5mg/mL不同質量濃度多糖溶液，測定OD415，實驗重復3次，結果取平均值，計算紅細胞溶血抑制率。

2 結果與分析

2.1 平菇菌絲體多糖提取優化試驗

按照表2進行平菇菌絲體多糖提取優化試驗并計算多糖提取率。

表2 平菇菌絲體多糖提取L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 Results of orthogonal experiments for optimizing extraction conditions of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

由表2可得，影響平菇菌絲體多糖提取的因素影響大小順序為加酶量＞溫度＞時間＞pH值。通過正交試驗確定平菇菌絲體多糖最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時間2h、pH5.3，重復實驗3次，平菇菌絲體多糖提取率為(4.91±0.15)%。

2.2 平菇菌絲體多糖分離純化

2.2.1 DEAE-32離子交換層析

由圖1可得，平菇菌絲體多糖分離得到3個主要組分，在相同質量濃度下，分別進行DPPH自由基清除能力檢測，各峰組分對DPPH自由基清除率分別為(11.25±0.09)%、(45.23±0.18)%、(3.16±0.05)%，故收集峰2組分進行進一步的分離。

圖1 平菇菌絲體多糖的DEAE-32洗脫曲線Fig.1 Elution profile of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium through DEAE-32 chromatography

2.2.2 SephadexG100凝膠過濾

圖2 平菇菌絲體多糖的Sephadex G100洗脫曲線Fig.2 Elution profile of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium through Sephadex G100 chromatography

由圖2可得，平菇菌絲體多糖分離得到2個主要峰，在相同質量濃度下，分別進行DPPH自由基清除能力檢測，各峰組分對DPPH自由基清除率分別為(61.16±0.15)%、(13.78±0.20)%，故大量收集峰1組分，進行純度鑒定。

2.3 平菇菌絲體多糖純度鑒定

2.3.1 紫外光譜掃描

圖3 平菇菌絲體多糖的紫外光譜Fig.3 UV-visible spectrum of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

由圖3可知，平菇菌絲體多糖僅在200nm波長處顯示多糖吸收峰，在波長260nm和280nm沒有明顯的吸收峰，表明此多糖基本無蛋白和核酸雜質存在。

2.3.2 醋酸纖維素薄膜電泳

將經過2種層析后分離得到的平菇菌絲體多糖，進行醋酸纖維素薄膜電泳實驗。所得到的條帶見圖4，也證明了平菇菌絲體中含有1種多糖，達到了電泳純。

圖4 平菇菌絲體多糖的醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig.4 Cellulose acetate electrophoresis of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium

2.4 體外抗氧化活性實驗

2.4.1 抗自由基能力測定

圖5 平菇菌絲體多糖清除自由基能力Fig.5 Scavenging capability of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium on free radicals

2.4.2 平菇菌絲體多糖對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血實驗的抑制作用

圖6 平菇菌絲體多糖對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血的影響Fig.6 Effect of polysaccharides fromPleurotus ostreatusmycelium on erythrocyte hemolysis induced by H2O2

如圖6所示，0.1～0.5mg/mL的平菇菌絲體多糖對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血都有抑制作用，且表現出一定的劑量-效應關系。表明平菇菌絲體多糖能明顯抑制溶血反應的發生，有效保護紅細胞結構的完整性。

3 結 論

3.1 通過酶法L9(34)正交試驗確定平菇菌絲多糖最佳提取條件，影響平菇菌絲體多糖提取的因素影響大小順序為加酶量＞溫度＞時間＞pH值。最佳提取條件為加酶量1.0%、溫度55℃、時間2h、pH5.3，平菇菌絲體多糖提取率為(4.91±0.15)%。

3.2 通過DEAE-32離子交換層析和Sephadex G100凝膠過濾分離純化平菇菌絲體多糖，收集抗氧化活性最高峰，其對DPPH自由基清除率為(61.16±0.15)%。

3.3 紫外光譜掃描和醋酸纖維素薄電泳對層析得到的多糖進行純度鑒定，電泳實驗結果得到單一條帶，證明該平菇菌絲體多糖為均一組分，并且不含有蛋白質、多肽及核酸成分。

3.4 經分離后的0.1～0.5mg/mL平菇菌絲體多糖對O－2·和·OH都有較好的清除效果，并對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血都有抑制作用，且表現出一定的劑量-效應關系，說明該平菇菌絲體多糖具有較高的體外抗氧化活性。

3.5 對平菇菌絲體多糖的分離、純化及體外抗氧化活性分析，為平菇的深加工和保健食品的開發利用上提供了基礎資料和理論依據，有關平菇菌絲體多糖的結構信息和生物學活性機理有待進一步研究。

[1] 焦帥, 阮榕生, 劉玉環, 等. Pb2＋·Hg2＋對平菇菌絲生長的影響及中微量元素對Hg2+的拮抗解毒效應[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(1):72-75.

[2] RUAN Zheng, SU Jie, DAI Hanchuan, et al. Characterization and immunomodulating activities of polysaccharide fromLentinus edodes[J]. International Immunopharmacology, 2005, 5(5):811-820.

[3] SHAO Baomei, DAI Hui, XU Wen, et al. Immune receptors for polysaccharides fromGanoderma lucidum[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 323(1):133-141.

[4] HUANG Qilin, JIN Yong, ZHANG Lina, et al. Structure, molecular size and antitumor activities of polysaccharides fromPoria cocosmycelia produced in fermenter[J]. Carbohydrate Polymers, 2007, 70(3):324-333.

[5] XIAO Jianhui, CHEN Daixiong, WAN Weihong, et al. Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation ofCordyceps jiangxiensisusing desirability functions[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(8):1887-1893.

[6] LI Xiaoling, ZHANG Hongbo, XU Haibo. Analysis of chemical components of shiitake polysaccharides and its anti-fatigue effect under vibration[J]. J Biol Macromol, 2009, 45(4):377-380.

[7] 卜慶梅, 王淑芳, 王瑜, 等. 四個平菇菌種液體培養選育研究[J]. 安徽農業科學, 2006, 34(3):458-459.

[8] 李機, 鄧啟華, 徐效圣, 等. 平菇液體菌種培養基的優化[J]. 新疆農業科學, 2010, 47(4):705-710.

[9] 申培麗, 趙超. 不同生理時期平菇多糖含量的比較研究[J]. 安徽農業科學, 2010, 38(2):681-683.

[10] 張玉林, 譚永忠. 平菇液體菌種栽培菌株篩選試驗[J]. 中國食用菌,2007, 26(5):32-33.

[11] 張揚, 熊耀康. 超聲波提取平菇多糖工藝研究[J]. 中國實用醫藥,2009, 29(4):13-14.

[12] 程超, 李偉, 汪興平. 平菇水溶性多糖結構表征與體外抗氧化作用[J]. 食品科學, 2005, 26(8):55-57.

[13] 劉振春, 蔣中華, 李慧, 等. 酶法提取榆耳菌絲體胞內多糖的工藝研究[J]. 食品科學, 2009, 30(13):201-204.

[14] 駱蘇芳, 彭樹靈, 劉國章, 等. 蒽酮硫酸法測定益元口服液中總多糖的含量[J]. 廣東藥學院學報, 2007, 23(1):3-4.

[15] 明建, 曾凱芳, 趙國華, 等. 羊肚菌水溶性多糖PMEP-1 的分離純化與結構特征分析[J]. 食品科學, 2009, 30(15):104-108.

[16] 李升鋒, 徐玉娟, 張友勝, 等. 不同荔枝品種果實品質、糖組分及抗氧化性的分析[J]. 食品科學, 2008, 29(3):145-148.

[17] 楊立紅, 黃清榮, 馮培勇, 等. 黃傘菌絲體多糖的分離鑒定及其抗氧化性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(23):131-134.

[18] 宋揚, 周順新. 猴頭多糖分離純化的初步研究[J]. 生物技術, 2007,17(5):82-83.

[19] 曹向宇, 劉劍利, 侯蕭, 等. 麥麩多肽的分離純化及體外抗氧化功能研究[J]. 食品科學, 2009, 30(5):257-259.

[20] 呂淑霞. 基礎生物化學實驗指導[M]. 北京:中國農業大學出版社,2003:77-82.

[21] 陳美珍, 余杰, 郭慧敏. 大豆分離蛋白酶解物清除羥由基作用的研究[J]. 食品科學, 2002, 23(1):43-46.

[22] 鮑素華, 查學強, 郝杰, 等. 不同分子量鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30(21):123-127.

Purification and Antioxidant Activity of Polysaccharides fromPleurotus ostreatusMycelium

CAO Xiang-yu，LIU Jian-li*，LU Xiu-li，LOU Hong，HUO Ya-peng
(School of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Q939.9

A

1002-6630(2010)22-0124-05

2010-08-01

遼寧省教育廳高等學校科學技術研究項目(2009A811； L20100154)；遼寧省科技廳農業攻關計劃項目(2009209001)；遼寧大學“211工程”三期建設項目

曹向宇(1980—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xiangyucao@yahoo.cn

*通信作者：劉劍利(1980—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：jianliliu@yahoo.com.cn