ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法檢測１０６例腦梗死凝血因子ⅩⅢ Ｖａｌ３４Ｌｅｕ基因多態性結果分析

【摘要】目的研究凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多態性的檢測方法，了解該基因突變在中國漢族人群中的分布頻率。方法應用聚合酶鏈反應(PCR)技術結合Hin6I酶切分析、瓊脂糖凝膠電泳確定基因型，對106例漢族腦梗死患者及120例正常人進行檢測，分析凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多態性特點。結果腦梗死組Val34Leu雜合突變頻率為3.8%，正常對照組為1.7%，兩組間基因型頻率分布無統計學差異(P均>0.05)。結論腦梗死患者凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突變頻率與正常人群無顯著性差異，建立的PCRRFLP方法適用于凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因突變的檢測。

【關鍵詞】聚合酶鏈反應；凝血因子ⅩⅢ；基因突變

文章編號：1003-1383(2006)03-0237-03

中圖分類號：R 446.62文獻標識碼：A

Analysis of coagulation factor ⅩⅢ Val34leu gene polymorphism in patients with cerebral infarction by PCRRFLP method

XIE Chunying， PAN Chunyan， TU Chunqing， WU Jianzeng， YE Guoqiang， DENG Chunyan.

(Department of laboratory science， Bao'an People's Hospital， Shenzhen， 518101， China)

【Abstract】ObjectiveTo establish a method for coagulation factor ⅩⅢ (FⅩⅢ) Val34leu gene polymorphism and study the frequency of genetic mutation in the Chinese Han population.

MethodsThe Val34leu genewas detected by combining the polymerase chain reaction (PCR) with Hin6I enzyme analysis and agarose gel electrophoresis in 106 patients with cerebral infarction and 120 normal controls. The characteristic of FⅩⅢ Val34Leu polymorphism was studied.ResultsThe Val34Leu heterozygote frequency in cerebral in fraction group and normal group was 3.8% and 1.7% respectively. The genetype frequency between the two groups had no difference. The gene frequency of Leu34 allele was 0.8%， which was lower than that of white people (27%).Con

clusionGene mutation of Val34Leu polymorphism has some differences in races or region. The polymerase chain reactionrestriction of fragment length polymorphism (PCRRFLP) methods is suitable for detection of FⅩⅢ Val34Leu gene mutation.

【Key words】polymerase chain reactionrestriction; coagulation factorⅩⅢ; gene polymorphism

凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)又稱纖維蛋白穩定因子，是一種轉谷氨酰胺酶原，在正常止血和傷口愈合過程中起重要作用，激活后的血漿FⅩⅢ是轉谷氨酰胺酶，其活性范圍大，可能與FⅩⅢ基因多態性有關，而FⅩⅢ基因多態性可能是動、靜脈血栓形成的一個保護性遺傳因素^[1，2]，近年來引起了國內外科學家們的密切關注，國內學者鮮有報道。為了解我國漢族人群FⅩⅢVal34Leu基因變異頻度，我們建立了PCRRFLP檢測方法，對106例腦梗死患者和120例正常漢族人群血標本進行檢測，現將結果報道如下。

材料與方法

1.材料

(1)標本來源106例漢族腦梗死患者為深圳市寶安區人民醫院神經內科住院患者，男性58例，女性48例，年齡35~87歲，符合1996年全國腦血管病學術會議修訂的診斷標準，并經CT或MRI證實。正常對照120例來自本院漢族健康體檢者，無缺血性心、腦血管病史及靜脈血栓史。于清晨空腹抽取病例及對照組外周血2 ml，EDTA抗凝，凍存于-20℃待測。

(2)試劑分離純化試劑盒(Puregene DNA isolarion Kits)為Gentra公司產品；Taq DNA聚合酶、dNTPmix、Hin6I限制性內切酶及分子量標準PUC19DNA/MspI為MBI公司產品；EZ Spin column PCR Product Purification Kit為Sangon公司產品。

(3)引物設計和合成根據Balogh等^[3]設計的引物，上游序列5’ACT TCC AGG ACC GCC TTT GGA GGC3’，下游序列5’GT TGA CGC CCC GGG GCA CCG-3’，下游序列3’端下劃線的G為一錯配堿基(原為A)，可以在正常序列(GCGC)中引入一個Hin6I酶切位點，而在變異序列(GCTC)中無Hin6I酶切位點。引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

(4)儀器PE9600型擴增儀系美國PE公司產品；臺式低溫高速離心機為美國Sigma產品，KODAK1D型凝膠成像系統購自美國IEC公司。

2.方法

(1)基因組DNA抽提取300 μl全血加入900 μl紅細胞裂解液，充分混合，室溫下孵育1分鐘，在相對離心力(RCF)13000~16000 g下離心20秒鐘，留下可見的白細胞層，再加入300 μl細胞裂解液混勻，然后經蛋白質沉淀、DNA沉淀、溶解，快速分離DNA。

(2)聚合酶鏈反應反應體系及條件參照文獻^[3]并略加改進?？傮w積為25 μl，含200 μmol/l dNTP，上、下游引物各10 pmol， 2.0 mmol/L MgCl2， 0.4 UTaq酶和0.5 μgDNA模板。反應條件為95℃3 min；循環：94℃1 mim，55℃1 min，72℃1 min，共35個循環；延伸72℃10 min。PCR擴增產物為114 bpDNA片段。

(3)限制性內切酶分析產物經EZ Spin column PCR Product Purification Kit純化，取純化的產物10 μl，用限制性內切酶Hin 6 I10U，37℃消化過夜，反應體積20 μl，取5 μl消化后產物在30 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察結果。

(4)基因型鑒定PCR擴增產物114 bp片段中存在一個Hin6酶切位點，可將片段切成94 bp、20 bp兩個片段，當FⅩⅢa亞單位2號外顯子上的34號密碼子發生GT突變，導致其編碼的纈氨酸被亮氨酸替代時，則消除了Hin6酶切點，因此，根據瓊脂糖凝膠電泳所見區帶的位置，以PUC19DNA/MspI/Maker作為標準分子量，從而鑒定基因型為突變純合子或Val34Leu雜合子或Val34野生型。

3.統計學處理

采用SPSS10.0 for windows統計軟件對組間基因型頻率的差異進行χ2檢驗。

結果

1.基因型電泳圖譜PCR產物經Hin6I酶切后瓊脂糖凝膠電泳只可見94 bp一條區帶，則受檢個體為Val34野生型(20 bp片段分子量較小而難以顯示)，如可見114 bp和94 bp兩條區帶者為Val34Leu雜合子，只可見114 bp條帶者為Leu34突變純合子，見圖1。

1，2，3，5，6，7：Val/Val；8：Val/Leu雜合子；

4：酶切前PCR產物；M: PUC19DNA/MspI/Maker圖1FⅩⅢVal34Leu基因型電泳圖

2.兩組FⅩⅢVal34Leu基因型分布頻率比較對照組FⅩⅢVal34Leu雜合突變頻率為1.7%，Leu34等位基因頻率為0.8%，腦梗死組的Val/Leu雜合突變率為3.8%，對照組為1.7%，兩組均未見純合突變型。兩組基因型及等位基因分布頻率比較均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

討論

FⅩⅢ是由2 a亞單位和2 b亞單位組成的四聚體，分子量為320 kb，活性部位在a亞單位，對FⅩⅢ亞單位缺失者的基因研究中發現了四種突變，其中編碼FⅩⅢa亞單位基因的第2外顯子163位有GT點突變，使a亞單位34位的纈氨酸變成亮氨酸(FⅩⅢVal34Leu)，故人群中出現三種基因型(多態性)：野生型Val/Val，雜合突變型Val/Leu，純合突變型Leu/Leu。多數研究認為，Val/Leu突變可能會防止病人的血栓形成，但可能是原發性腦出血的一種危險因素^{[1，2，4]}。也有報道認為Val34Leu突變與血栓形成沒有明顯關系，而同源Leu34等位基因才具有保護性作用，其原因在于這種等位基因可以增加血液中FⅩⅢ的濃度，從而加強了纖維蛋白交聯的形成。

不同種族、不同國家FⅩⅢVal34Leu多態性基因頻率的差異性很大，這可能是造成血栓性疾病在不同地區發生率不同的原因之一。據國外文獻報道^[5]，澳洲人基因頻率Val34為73%，Leu34為27%，德國人Val34為89%，Leu34為11%，日本人Val34與Leu34的頻率分別為99%和1%。我們研究106例腦梗死患者和120例正常人的FⅩⅢVal34Leu基因頻率，結果顯示，正常漢族人群中Leu34等位基因頻率為0.8%，明顯低于白種人，與日本人群相似^[6]，與國內謝汝萍等^[4]的研究結果(0.7%)基本一致，表明了黃種人(漢族)基因頻率比白種人低，FⅩⅢVal34Leu突變頻率在腦梗死與正常人組之間的差異無顯著性，提示FⅩⅢVal34Leu可能并非漢族人群血栓性疾病的保護性遺傳因素^[7，8]，采用PCRRFLP法檢測凝血因子ⅩⅢVal34Leu突變，對研究FⅩⅢ多態性與心腦血管性疾病的關系有一定意義。

參考文獻

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［3］Balogh I，Szoke G，Karpati L，et al. Val34Leu polymorphism of plasma factor ⅩⅢ:biochemistry and epidemiology in familial thrombophilia［J］.Blood，2000，96:2479-2486.

［4］謝汝萍，楊志杰，于敏，等.凝血因子ⅩⅢ基因Val34Leu突變與腦出血神經功能的相關性研究［J］.現代康復，2001，5(2)：92-93.

［5］Kangsadalampai S，Board PG.The Val34Leu polymorphism in the A subunit of coagulation factor ⅩⅢ contributes to the large normal range in activity and demonstratrates that the activation peptide plays a role in catalytic activity［J］.Blood， 1998， 92(8): 2766-2770.

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［7］涂傳清，吳建增，謝春英，等.深圳地區漢族人凝血因子ⅩⅢVal34Leu基因多態性研究［J］.廣東醫學院學報，2004，22(6)：566-567.

［8］涂傳清，吳建增，謝春英，等.漢族人群凝血因子ⅩⅢVal34Leu多態性與動靜脈血栓性疾病的關系［J］.中國臨床康復，2005，9(1)：70-71. 

(收稿日期：2006-04-10修回日期：2006-06-05)

(編輯：梁明佩英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文