色素上皮衍生因子對鼠視網膜新生血管形成的保護作用

【摘要】目的本課題通過小鼠視網膜新生血管動物模型觀察玻璃體內注入色素上皮衍生因子（PEDF）對視網膜新生血管形成的影響，并探討其治療作用。方法選取鼠齡為7天的健康昆明小鼠28只（56只眼），隨機分為4組：正常組、高氧組、PEDF干預組和對照生理鹽水組，每組7只。正常對照組鼠在正常空氣環境中飼養，其余3組鼠置于氧箱中，建立高氧誘導的視網膜新生血管動物模型。正常組鼠不做任何處理，PEDF干預組幼鼠在出生后第12天向玻璃體腔內注射PEDF 1 μl，而對照生理鹽水組注射相同體積的生理鹽水。各組小鼠均在出生后第17天處死，摘除眼球制作標本，進行組織病理學觀察。在光學顯微鏡下觀察并計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞細胞核數目。采用CD31分子免疫組化方法鑒別視網膜內界膜與血管內皮細胞。結果正常對照組標本HE染色未見突破內界膜的內皮細胞核，高氧組和對照生理鹽水組標本可見較多的突破內界膜的內皮細胞核，與正常組比較差異具有顯著性(P<0.05)，PEDF干預組的數目明顯少于高氧組和對照生理鹽水組，差異均具有顯著性(P<0.05)，且未見明顯藥物毒性反應。CD31分子免疫組化染色證實突破內界膜的細胞為血管內皮細胞。結論玻璃體內注入一定劑量的PEDF，能夠有效抑制高氧誘導下的小鼠視網膜新生血管形成，PEDF有望成為防治血管增生性視網膜病變的一種有效的方法。

【關鍵詞】視網膜新生血管；色素上皮衍生因子（PEDF）；血管生成抑制劑

文章編號：1003-1383(2006)03-0227-04

中圖分類號：R 339.146文獻標識碼：A

study on effect of pigment epithelialderived factor in the protection for retinal neovascularization in mice 

SUN Qingxiu1，NING Jianhong1，MENG Ruihua2

(1.Department of Ophthalmology，the 2nd Affiliated Hospital of Qingdao

University，Qingdao，Shandong，266000，China; 2.Department of phthalmology，the Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao，Shandong，266000，China)



【Abstract】ObjectiveTo study the effect and the therapeutically role of pigment epithelialderived factor (PEDF) in the protection for retinal neovascularization in mice.Methods①Twentyeight oneweekold Kunming mice were randomly divided into four groups: normal group， hyperxia group， PEDF group and 0.9%NaCl injected control group. The normal group was fed in the normal environment. The other groups were exposed to 75% oxygen to establish a model of retinal neovascularization. Mice in normal group did not receive any treatment. Mice in PEDF group were given an intravitreal injection of 1μl of PEDF and the same volume of 0.9%NaCl was injected into 0.9%NaCl group mice as a control. ②All mice were killed in 17day old. The eyes were enucleated for histological examination. ③the number of nuclei of endothelial cell extending from retinal internal limiting membrane was counted by optics microscope .the endothelial cell and retinal internal limiting membrane were identified by CD31 Immunocytochemical method .Resultsno nuclei of endothelial cell extending from retinal internal limiting membrane was found in normal group， while some were found in hyperxia group and 0.9%NaCl injected control group. there was significant difference between them (P<0.05). But less nuclei were found in the PEDF group .there was significant difference between them(P<0.05).and no side effect was found. the cells extending from retinal internal limiting membrane were confirm to be endothelial cell by CD31 Immunocytochemical method. ConclusionIntravitreal injection of PEDF may suppress the retinal neovascularization in the mice oxygen model which suggests that intravitreal injection of PEDF may have potential therapeutic benefits in retinal vascular disease.

【Key words】retinal neovascularization；pigment epithelialderived factor (PEDF)；hypertrophic scar

視網膜新生血管性疾病是人類致盲的重要原因，研究如何控制新生血管的發生以及使已經形成的新生血管退化，對治療這些疾病有重要意義。目前對新生血管性疾病主要采用激光和手術治療，雖然有效，但復發和一定程度的視功能損害一直是人們所困擾的問題，人們正期待著從分子生物學

作者簡介：孫清秀(1971-)，女，山東省榮成縣人，眼科主治醫師，醫學碩士。水平做進一步深入研究，期盼早日找到阻斷新生血管產生及活性的藥物。色素上皮衍生因子(PEDF)是一種內源性細胞因子，最先從人的色素上皮細胞調理液中提純出來的^[1]，具有保護神經視網膜，特別是光感受器的重要生理作用。Dawson等^[2]1999年首次發現PEDF還具有抑制血管增生的作用。國外學者對此進行了較多的研究，而國內學者關于PEDF對視網膜新生血管的作用報道較少。本文就PEDF和視網膜新生血管的關系作一研究，通過相對缺氧的辦法建立視網膜新生血管病變小鼠模型，并在其玻璃體腔內注射一定劑量的PEDF，觀察PEDF對視網膜新生血管形成的影響，從而為視網膜血管增生性疾病的藥物治療提供新的思路。

材料與方法

1.動物及分組選用出生7天的健康昆明小鼠（由青島市藥檢所動物實驗中心提供）28只，雌雄兼用，與哺乳母鼠共同飼養，隨機分為4組，每組7只。正常對照組：在正常空氣環境下飼養10天，不做任何處理；高氧組：在高氧環境下飼養5天，后在正常環境飼養5天，不注射藥物；PEDF干預組：在高氧環境下飼養5天，行玻璃體腔內注射PEDF，后置于正常環境中飼養5天；生理鹽水組：在高氧環境下飼養5天，行玻璃體腔內注射生理鹽水，后置于正常環境下飼養5天。

2.高氧誘導建立小鼠視網膜新生血管模型將鼠齡7天的幼鼠與同籠的1只哺乳母鼠一起置于密閉的氧箱內，另1只同籠的母鼠飼養在正常氧環境中作為替換母鼠。氧箱一端為進氣孔，接入100%濕潤醫用氧氣，流量控制在0.50~0.85 L/min， 氧箱內氧分壓維持在75%±2%；另一端為出氣孔，與水封瓶連接，頂端有測氧孔，用測氧儀監測氧箱內的氧分壓，確保氧濃度恒定。每日1次打開氧箱加食、換水、替換母鼠。環境溫度控制在23±2℃。

3.眼球標本的取材和固定氯胺酮(40~50 mg/kg)腹腔內注射，麻醉幼鼠，在手術顯微鏡下分開幼鼠上下眼瞼，用0.5%的卡因點眼，輕壓眶緣組織，使眼球脫出；用30 G自制針頭于角膜緣稍后進針；PEDF干預組注射PEDF 1 μl（2.5 μg/ml)，生理鹽水對照組注射生理鹽水1 μl；將眼球復位，0.25%氯霉素眼水點眼。各組幼鼠均于生后第17天取材，氯胺酮腹腔內注射麻醉成功后，暴露心臟，用37℃生理鹽水和4%多聚甲醛灌注；摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定；流水沖洗、常規酒精脫水、二甲苯中透明、60℃石蠟浸蠟然后包埋，備用。

4.視網膜組織切片HE染色將包埋好的眼球標本，做與視神經矢狀軸平行的視網膜連續切片，選取切片時避開視盤周圍，切片厚6 μm，每個標本取20張切片，置于干凈載玻片上，二甲苯脫臘、酒精復水、蘇木素染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察并照像記錄。

5.SABC免疫組織化學法檢測血管內皮細胞特異性抗體的化學標志CD31分子的表達從高氧組中選取視網膜組織切片，常規二甲苯脫臘，梯度酒精復水；3%H2O2室溫孵育，室溫下胰酶消化，微波修復，然后滴加1∶25稀釋的兔抗人因子相關抗原多克隆抗體， PBS沖洗，后滴加稀釋的生物素標記二抗，37℃孵浴，PBS沖洗；滴加稀釋的辣根酶標記鏈酶卵白素，37℃孵浴，PBS沖洗；DAB染色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。

6.視網膜組織切片的制作與觀察①HE染色：光鏡下觀察結果。每只眼球選取20張切片，計數與視網膜內界膜有聯系的血管內皮細胞細胞核。②免疫組織化學染色：從給氧組中隨機抽取20張未經染色的視網膜組織切片，應用對血管內皮細胞特異性免疫細胞化學標志的CD31分子行免疫組織化學檢查。以血管內皮細胞細胞質中見棕黃色顆粒為陽性。

7.監測小鼠體重的方法各組小鼠生后第12天始，每天同一時間用電子天平稱量體重一次，直至第17天，觀察小鼠第12天至第17天每天的體重變化。

8.統計學分析使用SPSS10.0 for windows軟件對所有數據進行統計學分析。各組間均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

結果

1.視網膜組織切片HE染色正常組未見明顯的突破內界膜的血管內皮細胞細胞核，見圖1；高氧組和生理鹽水組則顯著增多，有的形成新生血管芽，有的形成新生血管團，見圖2、圖3；PEDF干預組突破內界膜的血管內皮細胞細胞核明顯減少，見圖4。生后第17天正常組、高氧組、PEDF干預組及生理鹽水對照組平均每只眼球突破內界膜的血管內皮細胞細胞核數分別為（0.74±0.21）個、（28.27±3.14）個、（4.25±0.37）個、（26.83±2.80）個，組間比較，差異有統計學意義（F=2238.07， P<0.05），其中高氧組與正常組、PEDF干預組相比，差異有統計學意義（q=390.14，P<0.05）；PEDF干預組與生理鹽水對照組相比，差異亦有統計學意義（q=275.37，P<0.05）；生理鹽水對照組與高氧組相比，差異無統計學意義（q=1.49，P>0.05）。

2.CD31免疫組織化學染色隨機選取17 d齡給氧組小鼠視網膜組織切片20張，經CD31免疫組織化學染色識別血管內皮細胞。實驗結果顯示給氧組小鼠視網膜內界膜玻璃體面細胞胞漿呈棕黃色陽性反應，表明這些細胞為內皮細胞，證實它們為血管源性。見圖5。

圖5視網膜組織CD31免疫組織化學染色（HE×400）

3.體重變化生后第12~17天正常組、高氧組、PEDF干預組與生理鹽水對照組小鼠平均體重變化各組間比較(F=0.39，P>0.05)，PEDF局部治療對小鼠的生長發育無明顯影響。見表2。

討論

臨床上，視網膜新生血管常見于糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞等缺血性視網膜疾病。由于危害視力嚴重，一直是眼科關注的熱點。研究表明^[3，4]：缺血缺氧是視網膜新生血管產生的始動因素。抑制新生血管生長才是治療此病的關鍵，因此新生血管抑制因子的治療已成為較有前景的新生血管治療方法。

1.視網膜新生血管動物模型的制備科學可行的動物模型是研究視網膜新生血管形成機制及新生血管的治療方法療效評價的前提條件。理想的動物模型應當在疾病的發生發展以及病理檢查等方面相同或有極大的相似性，且模型有容易制作、便于觀察、可以重復和能定量分析等特點。目前應用最廣的模型是氧致小鼠視網膜新生血管動物模型^[5]，小鼠模型新生血管發生率為100%，且可重復性好，而且有可定量的最大優點，本實驗中，我們就采用此種動物模型。正常小鼠視網膜血管的發育在生后2周。生后第7天視網膜血管發育尚不成熟，此時置于高氧環境中，在高氧刺激下，視網膜血管發生收縮甚至閉塞，形成視網膜無灌注區^[6]。再將幼鼠移回正常空氣環境中，可以引發視網膜無灌注區缺血缺氧，2天后即可產生視網膜新生血管，在生后17~21天尤其是17天達到高峰。本研究中，我們選擇遺傳背景一致的健康昆明小鼠，建立高氧誘導的小鼠視網膜新生血管模型，使全部實驗動物產生基本一致的血管增生性反應，與正常對照組存在明顯差異，證實本次實驗動物模型誘發成功。評價新生血管的指標：一是通過視網膜鋪片上血管生長的范圍密度、新生血管芽的多少來反映視網膜新生血管的增殖程度。另一種方法即通過組織學計數切片上血管內皮細胞突破內界膜的數量即可反映新生血管的增殖狀態。前者是定性的方法，后者是定量的方法，均具有科學性和可行性。

2.局部注射的方法有資料顯示^[7]，全身使用PEDF如腹腔注射，需要的劑量較大，可能會干擾機體血管再生的整體調節，如在創傷和外周循環閉塞的情況下影響血供的恢復、傷口的愈合，從而增加全身的不良反應。由于眼部位置局限且表淺，局部注射有一定的優勢。局部注射包括2種方式：玻璃體內注射和視網膜下注射。實驗中，我們采用局部注射即玻璃體腔內注射，既避免出現全身并發癥，又能更好地維持眼內的治療濃度。且小鼠眼球容易脫臼，暴露好，角膜緣邊界清楚，易于定位，我們用30 G自制針頭行玻璃體內注射，操作方便，并發癥少。

3.PEDF對小鼠視網膜新生血管的作用PEDF是一種內源性細胞因子，主要由RPE產生，具有保護神經視網膜，特別是光感受器的重要生理作用，是視網膜正常發育必需的營養因子。Dawson等^[2]還認為PEDF是一種重要的內源性新生血管的抑制因子。有研究報道體內體外實驗中PEDF可以通過抑制血管生成從而抑制多種腫瘤的生長，其用于腫瘤治療的潛在可能性已引起人們的注意。但PEDF是否對眼部新生血管有抑制作用？實驗中，我們用自制針頭通過硅膠管連于微量進樣器自角鞏膜緣穿刺，向小鼠玻璃體腔內注射PEDF 1 μl (2.5 μg/ml)，觀察其對視網膜新生血管形成的影響。結果表明，一定劑量的PEDF對視網膜新生血管形成具有抑制作用，PEDF干預組與高氧組和生理鹽水對照組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。但PEDF尚不能完全抑制視網膜新生血管的形成。PEDF干預組與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明PEDF僅能部分抑制視網膜新生血管形成。分析原因可能有：首先視網膜新生血管的生長是一個復雜的過程，需要多種因子參與，單一因素并不能阻止新生血管的生長；另外，PEDF的作用效果呈量效關系^[8]，若劑量不足夠大，也不能完全抑制新生血管形成。 PEDF抑制視網膜新生血管形成的具體機制目前尚不明確，推測有以下可能：一是可能通過促進活化的血管內皮細胞凋亡，使血管內皮細胞對缺氧誘發的新生血管的信號不起反應^[7]。二是可能通過作用于細胞黏附分子來調節其抑制新生血管的活性，即通過細胞外基質來調節其抑制血管內皮細胞增生的活性^[9]。三是PEDF還可以通過其抗氧化特性減輕糖基化終產物對血管周細胞的損害^[10]，起到保護作用，從而發揮治療作用。本研究中，我們向玻璃體內注射一定劑量的PEDF，觀察視網膜組織切片，未見到明顯異常。監測各組小鼠體重，差異無統計學意義(P>0.05)，說明局部注射PEDF并不干擾小鼠的正常生長發育，預示了PEDF治療眼內新生血管的安全性和可行性。

由于視網膜本身主要由神經組織構成，且發生缺血缺氧損害時易產生視網膜新生血管，PEDF作為一種內源性因子，不僅具有神經營養作用，可以保護神經組織免遭毒性損害 ，而且還可以抑制新生血管的形成，這預示了PEDF預防和治療血管增生性眼病的可行性和廣闊前景，PEDF有望成為防治血管增生性視網膜病變的一種有效藥物。

參考文獻

［1］Zhang S，Leske DA，Holmes JM.Neovascularization grading methodsin in a rat model of retinopathy of prematurity［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;41(3):887-891.

［2］Dawson DW，Volpert OV，Gillis P，et al.Pigment epithelium-derived factor :a potent inhibitor of angiogenesis［J］.Science，1999;285(5425):245

［3］Aiello LP.Vascular endothelial growth factor 20th-century mechanisms，21st-century therapies［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci.1997，38:1647-1652.

［4］Miller JW.vascular endothelial growth factor and ocular neovascularization［J］.AM J Pathol，1997，151:13-23.

［5］Pierce EA，Avery RL，Foley E，Aiello LP，Smith LE.Vascular endothelial growth factor /vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization［J］.Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:905-909.

［6］Smith LEH， Wesolowski E， Mclellan A，et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35:101-111.

［7］Stellmach V，Crawford SE，Zhou W，et al.Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:2593-2597.

［8］Stellmach V，Crawford SE，Zhou W，et al.Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:2593-2597.

［9］Yasui N，Mori T，Morito D，et al.Dual-site recognition of different extracellular matrix components by anti-angiogenic/neurotrophic serpin，PEDF.Biochemistru，2003;42(11):3160

［10］Yamagishi S，Inagaki Y，Amano S，et al. Pigment epithelium-derived factor protects cultured retinal pericytes from advanced glycation end product-induced injury through its antioxidative properties. Biochem Biophys Res Commun，2002;296(4):877

(收稿日期：2006-03-27修回日期：2006-05-28)

(編輯：潘明志英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文