多功能生長因子ＰＴＮ與受體相互作用及跨膜信號傳導

摘 要：PTN家族由兩個成員組成，PTN(pleiotrophin)和MK(midkine)，PTN是由136個氨基酸組成的18kD分泌型多功能生長因子，MK與PTN有50％的氨基酸同源性，它們在正常的細胞的生長、分化和遷移過程中起著重要的作用，也在一些病理過程中，如腫瘤和老年性癡呆中扮演著重要角色，最近發(fā)現(xiàn)它們與酪氨酪蛋白激酶磷酸酶受體RPTPβ/ζ相互作用，調節(jié)底物β－Catenin(連環(huán)蛋白)的酪氨酸磷酸化水平，從而加深了對其生物學意義的了解，也為Ptn和Mk異常表達引起的疾病，如腫瘤和老年性癡呆的治療提供了新的藥物作用靶點。

關鍵詞：多功能生長因子PTN； MK；信號傳導

中圖分類號：R994

文獻標識碼：A

文章編號：1007－7847(2007)01－0001－09

1 PTN、MK的來源和蛋白質結構

細胞外信號分子，例如生長因子，細胞因子，激素和細胞外基質蛋白在正常的生長和發(fā)育過程和一些病理過程中起著重要的作用，PTN(也叫HB－GAM)和MK是肝素結合生長因子，是這個家族中僅有的兩個成員，它們不同于其它的肝素結合生長因子，PTN是一種18kD的肝素蛋白，最早是從牛的子宮純化而得，對成纖維細胞具有弱的促有絲分裂作用^[7]，而且同時發(fā)現(xiàn)它是一種從新生大鼠腦中提取能夠促進神經細胞軸突生長的因子，現(xiàn)在人、牛、大鼠、小鼠和雞的PTN、cDNA已經克隆和測序，編碼一種168個氨基酸的蛋白質，包括32個氨基酸組成的信號肽，不同種屬的Ptn基因高度保守，是目前所知的所有生長因子中最保守的一種基因，Mk是通過篩選胚胎癌細胞中用維甲酸誘導表達的基因，從雞的基底細胞也純化到同源蛋白，PTN和MK是富含半胱氨酸和堿性氨基酸的蛋白質，在脊椎動物，所有PTN和MK的10個半胱氨酸是保守的(圖1)。

這兩種蛋白質的氨基酸的同源性約為50％，兩種蛋白由兩個結構域組成，C末端和N－末端，NMR結構分析顯示，這兩種蛋白質的三維結構很相似的(圖2)。

每個結構域由3個反向平行的β-片層組成，兩個結構域由一個可變的結構區(qū)相連，雖然精確的結構和功能關系還有待闡明，有趣的是編碼PTN的N-末端和C-末端cDNA至少可以轉化NIH 3T3細胞，而MK只有C-末端有生物活性，例如，神經細胞軸突生長，纖維溶解和神經細胞的遷移功能，PTN和MK中的半胱氨酸殘基通過二硫鍵相連顯示這類蛋白質在不同pH、滲透壓和有機溶解劑中都是很穩(wěn)定的，PTN和MK從果蠅到人都存在，因此，推測其C－末端的結構是重要的，值得注意的是斑馬魚PTN的N，末端結構域(Mdk2)和人PTN的N－末端的部分結構域分別對神經發(fā)生和人乳腺癌細胞的生長具有優(yōu)勢負調控作用，PTN與肝素具有高親和力，在細胞外它與肝素分離后被釋放到細胞外基質中，通過CD和NMR分析顯示肝素可以誘導PTN的構象改變，其與肝素的結合位點也位于β－，片層結構中，在人和鼠MK的C－末端發(fā)現(xiàn)兩個肝素結合簇，簇I(人MK K79，R81和K102)和簇II(人MK K86 K87和R89)，簇I識別硫酸肝素和硫酸軟骨素蛋白聚糖，在神經細胞遷移時的相互作用，以及MK和酪氨酸蛋白磷酸酶RPTPβ/ζ的相互作用時起著重要作用。

2 Ptn和Mk的基因表達

Ptn基因在大鼠和小鼠發(fā)育的神經外胚層和中胚層的特殊細胞和特定階段表達，出生后在腦組織中的表達很快達到高峰，體內的膠質細胞和神經細胞在表達的時間上有所不同，在成年，Ptn在睪丸子宮和一些膠質和神經細胞中持續(xù)表達，并且Ptn的表達還受到PDGF的上行調節(jié)，Ptn是首先從與PDGF同源的V-sis原癌基因轉化的NIH 3T3細胞中發(fā)現(xiàn)的，隨后從牛的子宮也純化到，并發(fā)現(xiàn)對NIH 3T3和NRK鼠成纖維細胞具有促生長作用，在V-sis轉化的細胞中Ptn的高表達與PDGF對Ptn基因的上行調節(jié)相一致，Pin基因5-末端的啟動子有一對PDGF刺激起上行反應調節(jié)的血清反應元件，相反Mk基因的表達不受PDGF刺激的影響，但Mk的表達受到維甲酸的刺激而表達增加，人Mk基因的5-調控區(qū)含有一個維甲酸的反應元件和兩個WT-1反應元件，維甲酸通過維甲酸反應元件誘導Mk基因的表達，WT-1反應元件中對WT-1起反應，導致Mk的表達降低。

在大鼠的腦缺血損傷過程中，Ptn基因表達水平增高，動物實驗結果顯示，在腦缺血損傷1-3d時內皮細胞，巨噬細胞和星狀細胞的Ptn表達增加，缺血損傷7-14d天仍維持高水平的表達，此外，動物實驗結果還顯示，在創(chuàng)傷愈合過中，Ptn的表達增加，Ptn可能參與創(chuàng)傷愈合過程中的細胞增殖過程。

Ptn的基因表達也受到激素的調控，在成年的子宮Ptn的轉錄受到雌激素的調節(jié)，在妊娠期Ptn的表達水平最高，發(fā)情期當雌激素水平達到高峰時，Ptn的表達最低，一種來源于前列腺分泌腺的細胞株，當細胞經過二氫睪酮、睪酮和雌激素處理后，再加入特異性的雄性激素抑制劑處理細胞時，Ptn的表達水平則降低，爪蟾中Mk是在原腸胚后期的神經基底表達，從這個階段到尾芽期，幾乎在所有神經組織中都能檢測到Mk的表達，例如腦和神經管，應當注意到鼠的早期神經發(fā)育期，Ptn和Mk的表達不同，Mk的表達開始在E5.5的整個胚胎外胚層，而Ptn的表達E8.5的神經褶處，在E11.5的神經管中，Mk的表達局限在室區(qū)的神經干細胞，而Ptn的表達到室區(qū)的背側，這種Ptn和Mk表達的不同可能影響神經發(fā)育的區(qū)域特異性，在神經肌肉接頭的發(fā)育過程中，兩種蛋白誘導爪蟾乙酰膽堿受體聚集在神經肌肉接頭部位，MK在脊髓的神經細胞而PTN存在于肌肉細胞，兩種蛋白都與一種硫酸肝素蛋白聚糖相結合，這種聚糖蛋白在神經肌肉的發(fā)育過程中起著重要作用。

3 PTN和MK的多功能生物活性

已知PTN具有多種功能作用(見圖3)。

3.1 有絲分裂原作用

PTN能促進V-Sis原癌基因轉化細胞和牛子宮細胞的DNA合成，對內皮細胞，上皮細胞和成纖維細胞具有有絲分裂原作用，但PTN的有絲分裂原作用已受到挑戰(zhàn)，一些研究者用昆蟲和細菌表達的重組PTN具有促使軸突生長的作用，但不表現(xiàn)有絲分裂原樣作用，這可能是由于在PTN的折疊和加工過程中使其失去刺激細胞增殖的活性，也可能是因為PTN的有絲分裂原作用需要刺激細胞周期后和其它基因表達后使細胞分化到一定階段后才表現(xiàn)出來，有結果顯示PTN的刺激DNA合成也是在PTN作用細胞16h后才表現(xiàn)出來。

3.2 促進神經細胞軸突生長和參與神經細胞損壞性疾病過程

PTN能夠促進不同神經細胞軸突生長，包括培養(yǎng)的胚胎細胞、外周皮質細胞、神經細胞瘤和PCI2細胞，在原代細胞培養(yǎng)中，PTN加入發(fā)育中的皮質和脊髓膠質前體細胞也促使軸突生長，結果表明PTN對少突神經膠質細胞的分化特征起著重要作用，在前體細胞加入抗PTN的抗體后，這些細胞的分化過程減緩，顯示PTN對這些前體細胞不僅重要而且是必須的，PTN刺激少突神經膠質細胞后，細胞產生一些分化標志物，綜上所述，PTN可能參與少突膠質細胞的分化以及加速少突膠質細胞前體細胞向少突膠質細胞的分化過程，在老年性癡呆病人中發(fā)現(xiàn)PTN存在于老年性癡呆和Down’s綜合癥的老年斑中，MK也存在于老年斑和神經纖維角中，PTN和MK可能與一種低密度脂蛋白受體(LRP)相互作用，后者是老年性疾呆發(fā)病過程中淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)apoE和α－2M的主要受體，因此，PTN和MK在老年性癡呆癥中可能具有潛在的重要作用。

3.3 促血管形形成作用

PTN也參與血管形成，用1、3和7d的缺血損傷大鼠試驗證實了PTN在缺血損傷中起著重要作用，PTN在損傷皮層新生血管的周圍表達，并且僅在血管內皮細胞，活化的巨噬細胞和活化的星狀細胞出現(xiàn)，PTN能夠促進培養(yǎng)的內皮細胞的增殖和DNA的合成，牛毛細血管內皮細胞在基質膠表面管狀結構的形成在缺少PTN的情況下，2－7d管狀結構的形成較弱而且不能維持管狀結構，在加入外源性PTN后管狀結構能夠維持7d，這表明PTN在體外和體內都參與血管形成，而且發(fā)現(xiàn)PTN的69-136氨基酸殘基，存有一個能夠促進血管形成的結構域，該結構域不能導致NIH3T3細胞轉化，但卻能促進SW13細胞在裸鼠體內腫瘤血管的形成，這可能與結構域能促進SW13細胞釋放bFGF有關，Mk基因敲除小鼠顯示Mk參與血管的再狹窄過程，Mk基因敲除后血管新內膜的形成減少，而且MK還可以促進吸引炎癥反應細胞和小平管肌細胞參與血管的形成過程，有試驗表明，MK還促進成纖維細胞介導的膠原收縮和誘導小平管肌細胞分泌一些細胞因子，例如IL-8，從而對內皮細胞起作用，這些作用可以改變血管壁的結構和微環(huán)境。

3.4 參與骨、腎、肺和牙齒的發(fā)育過程

在胚胎發(fā)育過程中，Ptn和Mk在上皮，間質發(fā)生作用時表達，牙齒、肺、腎和一些典型的器管就是通過上皮，間質相互作用而形成的，Ptn在輸尿管的周圍粘膜組織中表達，PTN和GDNF一起，在體外能誘導輸尿管長出分支，PTN能刺激雞肢芽軟骨素的形成，Ptn轉基因小鼠骨發(fā)育異常，將Mk cDNA轉染到骨前體細胞能夠促進前體細胞分化為軟骨細胞，Ptn和Mk能夠誘導成骨細胞的遷移，Mk在胚胎和肺發(fā)育的假腺階段表達，在小管和束狀階段(從E15.5到出生)階段降低，MK能刺激移植出的胚胎肺的發(fā)育，重要的是Mk在出生后發(fā)育階段短暫的表達增加，在出生后，糖皮質激素和維甲酸調節(jié)出生后的發(fā)育，而MK在出生后能夠被維甲酸上調，抗MK的抗體，體外能抑制腎單位和移出的牙胚發(fā)育的形成，這表明Mk也參與腎和牙齒的發(fā)育過程，實驗還表明，MK可能還參與間質腎炎的病理發(fā)生過程。

4 PTN和MK與癌

癌癥的發(fā)生過程是一系列的分子事件的作用引發(fā)的，包括基因突變，例如ras和p53基因突變，生長因子和受體的過度表達，突變后的細胞能夠惡性增長和易轉移，并對藥物產生抗藥性．激活的PTN，可能還通過某種信號轉導途徑使腫瘤細胞更惡性增長，因為發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中，Ptn和Mk都是高表達的，Mk在腫瘤組織中的表達比Ptn更廣泛，但Ptn在神經細胞瘤、神經膠質瘤、卵巢癌、前列腺癌、Wilms瘤、絨癌和黑色素瘤中高表達，在上述這些腫瘤組織中內源性的Ptn基因持續(xù)活化，而在相應的非瘤組織中很難檢測到Ptn的表達而Mk在食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、直腸癌、肺癌、Wilms瘤中高表達，兩者在乳腺癌細胞都處于高表達狀態(tài)，Ptn在神經細胞瘤的早期高表達，Mk在神經細胞瘤各個階段都高表達，PTN和MK能夠促進細胞遷移的功能可能與腫瘤的轉移有關，在神經母細胞瘤中PTN和它的受體RPTPβ/ζ都表達增加，它們的表達水平與該腫瘤惡性程度有關，更直接的證據來源于將Ptn轉入NIH3T3細胞和Ptn基因的優(yōu)勢負調控結構域轉入NIH3T3細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞中，Ptn能促使NIH3T3細胞轉化為惡性細胞，而Ptn的優(yōu)勢負調控區(qū)則能減少MDA-MB-231細胞軟瓊脂和裸鼠體內的克隆和腫瘤形成，并顯示PTN(1-40氨基酸殘基)做為負調控結構域可以用抑制腫瘤的生長，具有潛在的應用前景。

PTN和MK能提高牛內皮細胞內的尿激酶(PA)的活性，并且是劑量和時間依賴性的，PA具有纖維溶解活性，另外，也發(fā)現(xiàn)PTN和MK也可以通過下調尿激酶抑制劑(PAI)的水平而增加溶解纖維的活性，由于Mk和Ptn在多種腫瘤組織中特異性高表達，它們可與P53基因突變一樣做為腫瘤的標記物，不同的是MK和PTN是分泌型的，在血液中可能容易檢測到，而且發(fā)現(xiàn)100％的胃癌癌旁組織有Ptn mRNA表達，PTN蛋白在癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，有遠處轉移明顯高于沒有轉移的病側，這表明PTN蛋白表達與胃癌侵襲性生長有一定關系。

有趣的是，幽門螺旋桿菌分泌的外毒素VacA能與PTN的受體RPTPβ/ζ結合，而導致胃潰瘍，而幽門螺旋桿菌被認為是誘發(fā)胃癌的病因之一。

5 PTN通過酪氨酸蛋白磷酸酶受體RPTPβ/ζ介導膜信號傳導

PTN和MK為多功能分泌型生長因子需要與細胞膜表面的受體相互作用，通過信息傳遞實現(xiàn)其多功能生物學功能，自從PTN發(fā)現(xiàn)以來，雖然發(fā)現(xiàn)它與細胞表面的多種蛋白相互作用，但功能上的生物學意義并不清楚。

最近，我們發(fā)現(xiàn)PTN是酪氨酸蛋白磷酸酶受體(RPTPβ/ζ)的一種功能性配體，這一發(fā)現(xiàn)的重要性在于這是迄今為止所有已知的30多種受體酪氨放蛋白磷酸酶家族中發(fā)現(xiàn)的第一個異源性功能配體，其重要意義在于我們清楚觀察到配體PTN與受體RPTPβ/ζ結合的功能反應，而且能增加受體底物β－Catenin的酪氨酸磷酸化水平，這是首次觀察到酪氨酸磷酸酶受體與功能性配體結合后引底物酪氨酸磷酸化水平的改變，而且發(fā)現(xiàn)PTN處理細胞后，β－Catenin的酪氨酸磷酸化水平迅速增加，但β－Catenin與E-Cadherin的結合卻迅速減少，這些結果說明，PTN與RPTPβ/ζ結合后，能引起受體RPTpβ/ζ的酶活性迅速降低，從而使RPTPβ/ζ對底物及Catenin的脫磷酸化作用降低，這與RPTPα的結晶結構，配體與受體結合區(qū)形成的二聚體引起酶活性結構域構象的改變，阻止底物進入RPTP的活性部位的結果一致，PTN和RPTPβ/ζ的相互作用，則為RPTPS的結構模型提供了最好的體內實驗證據，RPTPβ/ζ基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，RPTPβ/ζ在實驗性自動免疫腦脊髓炎和多種硬化癥的恢復過程中起著關鍵性的作用，試驗還發(fā)現(xiàn)它參與神經損傷的修復和軸突生長的作用，這與PTN的功能表現(xiàn)相一致，實驗結果還顯示。PTN處理U373MG能使E-Cadherin和β－Catenin的結合減少，因為細胞與細胞之間的粘連取決于E-Cadherin與Catenin家族成員的結合，E-Cadherin的聚集是通過其相連的α、β和γ-Catenin與細胞骨架肌動蛋白相連，這種復合體的形成對于E-Cadherin調節(jié)細胞的粘附作用以及把E-Cadherin與連接到其它膜本體蛋白(integral membrane protein)起著關鍵作用，PTN刺激細胞后將減弱細胞間的粘連作用，從而有利于細胞的遷移和腫瘤細胞的轉移，由于β－Catenin在細胞間的連接細胞骨架結構和正常細化轉化方面起著重要作用，因此，PTN對β－Catenin酪氨酸磷酸化的調節(jié)作用具有重要的潛在生物學意義，Ptn在轉化細胞中的持續(xù)表達使細胞之間失去接觸抑制作用，并引起細胞骨架結構的破壞，有利惡性腫瘤細胞的生長和轉移，由于在結腸癌中已發(fā)現(xiàn)了Ptn的高表達和β－Catenin高水平的酪氨酸磷酸化，因此，PTN信號轉導與Wnt/Wingless和APC－/－結腸癌信號聯(lián)系在一起。

此外，還發(fā)現(xiàn)Adducin-2β和GIT－1/Cat－1作為RPTPβ/ζ的底物，PTN刺激細胞后，Ad－ducin-2β的酪氨酸和713，726磷酸化水平增加而且Adducin-2β在PTN刺激30min后，Adducin-2β的蛋白水平迅速降低，Adducin-2β的結合不穩(wěn)定，從而導致細胞骨架不穩(wěn)定，細胞骨架的不穩(wěn)定使腫瘤的惡性程度增加，并且使腫瘤更具侵襲性，用底物誘捕結合酵母二次雜交技術，發(fā)現(xiàn)RPTPβ/ζ也可以與GITI相結合，而且PTN可以調節(jié)GITI/Cat－1的酪氨酸磷酸化水平，GITI/Cat-1是一種G蛋白偶聯(lián)受體激酶反應蛋白，使得PTN-RPTPβ/ζ-G蛋白信號傳遞聯(lián)系在一起，其交互作用及生物學意義有待進一步的闡明，對PTN-RPTPβ/ζ信號轉導途徑的研究已應用于神經母細胞的治療策略中，PTN和RPTPβ/ζ胞外區(qū)已成為癌癥治療的新靶點，PTN的核酶和MK的反義RNA以及RPTPβ/ζ胞外區(qū)的單克隆抗體和PTN和RPTPβ/ζ胞外的優(yōu)勢負調控結構域也成為癌癥治療的分子靶點，現(xiàn)已將其應用于臨床實驗，這將為癌癥治療提供了一種新方法，最近，通過應用針對PTN特異的SiRNA，表明沉默Ptn基因可抑制PTEN基因缺失細胞的增殖，并在裸鼠體內證實沉默PTN可使PTEN/MEF241細胞在裸鼠成瘤率被顯著抑制，因此針對PTN及受體可能成為一種新型的腫瘤治療藥物，另外血液中MK和PTN可作為腫瘤檢測和判斷預后的標記物，為監(jiān)控腫瘤的發(fā)展和評價治療效果提供有用的信息。

6 結語

PTN和MK是一族參與細胞的生長、分化、發(fā)育、損傷修復和多種病理過程(腫瘤，老年性癥呆和腎炎)的多功能生長因子，它們的表達水平和活性受到嚴格的調控，當它們的調控失調時，可以參與一些疾病的發(fā)生和發(fā)展，隨著我們對PTN和MK與受體及底物信號轉導途徑的深入了解，將可為一些疾病的治療提供新的藥物作用靶點，

最近，Lu等人研究發(fā)現(xiàn)PTN存在以18kD和15kD的兩種形式存在，15kD的PTN是由18kD的蛋白質C－末端去掉12個氨基酸產生的，有趣的是這兩種形式的PTN分別作用于不同的受體，18kD的PTN結合RPTPβ/ζ，而15 kD的PTN結合anaplastic lymphoma kinase(ALK)，前者介導的信號傳導與細胞的遷移有關，后者介導的信號傳遞與MAP激酶介導的增殖信號傳遞有關。

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