蘿卜花藥愈傷組織誘導(dǎo)與分化影響因素的研究

摘 要：以5個蘿卜品系為材料探討了不同培養(yǎng)方式、激素與基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響．結(jié)果表明固液雙層培養(yǎng)較固體與液體培養(yǎng)效果好，0.2mg/L 2，4-D與4.0mg/L KT+0.2mg/L NAA對花藥愈傷誘導(dǎo)率較高，4.0mg/L KT+0.2mg/L NAA的激素組合愈傷組織生長快，NAA為2.0mg/L時根分化明顯，各種激素處理均未見芽的分化，5個品系中NAU-Yb-03與NAU-Dy－13－03對激素反應(yīng)較為敏感；NAU-Dq-03在所有的處理中均未見愈傷組織的形成。

關(guān)鍵詞：蘿卜；花藥；愈傷；培養(yǎng)方式；激素；基因型

中圖分類號：S631.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847(2007)01-0090-05

蘿卜(Raphnus sativus L.)為十字花科重要蔬菜作物，我國作為其起源地之一，有著豐富的種質(zhì)資源，充分利用這些資源進(jìn)行品種改良，獲得優(yōu)良的新品種對于提升我國蘿卜生產(chǎn)水平有著重要作用，利用單倍體進(jìn)行種質(zhì)資源遺傳研究與新品種的選育具有快速、穩(wěn)定的優(yōu)點，目前獲得單倍體的主要方法有理化誘變、遠(yuǎn)緣雜交、大孢子培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)等，其中花藥培養(yǎng)是目前運(yùn)用最為廣泛的方法之一，并已在番茄、辣椒、大白菜等多種蔬菜作物中得到了應(yīng)用，在蘿卜上，Lichter等(1989)首先通過小孢子培養(yǎng)獲得了蘿卜單倍體植株，但這種培養(yǎng)方式由于受到基因型的限制，誘導(dǎo)率仍很低，梅時勇等(2002)首先報道對不同蘿卜品種進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得了蘿卜單倍體植株，但是對于其高頻離體誘導(dǎo)培養(yǎng)體系仍存在許多限制因素，為此開展蘿卜花藥單倍體誘導(dǎo)體系研究有著重要的理論和實踐意義。

如何改變小孢子發(fā)育途徑，使小孢子脫分化形成無極性的愈傷組織或者胚狀體，進(jìn)而再分化或直接形成植株是花藥單倍體高頻再生體系建立的關(guān)鍵，其中通過愈傷組織形成植株是最常見的發(fā)育途徑，離體條件下采用的培養(yǎng)方式、激素類型與濃度以及基因型的選擇是影響花藥愈傷組織形成與再分化的重要因素，為此本研究從這3個方面對影響蘿卜花藥愈傷組織脫分化與再分化的因素進(jìn)行探討，以期為蘿卜單倍體高頻誘導(dǎo)體系的建立提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用NAU－Dy-13-03，NAU-Yb-03，NAU-Lcxh-02、NAU-Cdms-04、NAU-Dq-03等5個高代自交系為材料，2005年春季種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦園藝站。

選取健壯植株上處于單核靠邊期的花蕾(約為2－4mm)，將花序軸插入水中，置于4℃冰箱中低溫處理2d，接種前將花蕾用75％酒精浸泡30s，然后置于0.1％HgCl₂中消毒7min，無菌水沖洗3次。

1.2 花藥愈傷組織的誘導(dǎo)

以NAU－Dy－13－03為材料，采用固體、液體、固液雙層3種培養(yǎng)方式，分析不同培養(yǎng)方式對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響；以固液雙層方式分析不同激素組合對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響；以5個蘿卜高代自交系為材料。設(shè)置I、V、X、XIV、XV、XVI5組激素組合(表1)，通過固液雙層培養(yǎng)方式，分析不同基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響，固體培養(yǎng)培養(yǎng)基采用MN(N_6大量+MS_{微量+有機(jī)})+0.65％瓊脂+6％蔗糖+不同激素配比，每個60×15mm培養(yǎng)皿20mL；液體培養(yǎng)采用MN+6％蔗糖+不同激素配比，每個100mL錐形瓶20mL；固液雙層培養(yǎng)下層固體培養(yǎng)基采用MN+0.65％瓊脂+6％蔗糖，上層液體培養(yǎng)基采用MN+6％蔗糖+不同激素配比，每個60×15mm培養(yǎng)皿固體培養(yǎng)基1.5mL，液體培養(yǎng)基2mL，各種激素配比如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對花藥愈傷誘導(dǎo)的影響花藥接種在3種培養(yǎng)基上反應(yīng)不同，在液體培養(yǎng)條件下，花藥大小無明顯變化，顏色由綠色漸漸轉(zhuǎn)為淺褐色，培養(yǎng)30d未見愈傷組織形成，固體培養(yǎng)與固液雙層培養(yǎng)在培養(yǎng)4d后，花藥形態(tài)上開始發(fā)生變化，固體培養(yǎng)在激素配比VI、XIV、XV下花藥顏色由綠色轉(zhuǎn)為淺黃色，并向花藥內(nèi)側(cè)彎曲，形成弓形，3個星期后可見黃色的愈傷組織形成，愈傷組織形成量極少，并且生長慢；處理X與XⅥ下花藥黃化并逐漸轉(zhuǎn)為褐色；其它激素配比無明顯反應(yīng)，在固液雙層培養(yǎng)條件下，當(dāng)在V與X激素配比時花藥發(fā)生彎曲，但呈綠色，兩個星期后即可見白色愈傷組織形成并有光澤，生長快，可見，花藥在固液雙層培養(yǎng)下能夠保持較高的活性，并且形成的愈傷組織活力較高，可能是這種培養(yǎng)方式更有利于激素吸收利用。

2.2 不同激素類型與濃度對花藥愈傷組織誘導(dǎo) 影響

2.2.1 不同濃度KT對花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響在固液雙層培養(yǎng)條件下，不同濃度的KT對NAU－Dv－13－03蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果(表2)表明．添加較低濃度的細(xì)胞分裂素KT有助于愈傷組織的形成(處理Ⅱ)，但愈傷組織生長相對較慢．當(dāng)KT達(dá)到2.0mg/L時(處理Ⅲ)，花藥由綠逐漸轉(zhuǎn)黃，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯降低。4.0mg/L時花藥受到明顯的抑制作用，花藥轉(zhuǎn)為深黃色，體積變小，未見愈傷組織形成，可見單獨(dú)使用KT雖然有少量愈傷組織的形成，但是愈傷組織生長狀態(tài)較差，高濃度對愈傷組織誘導(dǎo)表現(xiàn)負(fù)作用。

2.2.2 不同濃度2，4－D對花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響

在固液雙層培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)?，4－D(處理V、Ⅵ)，對NAU－Dy－13－03花藥愈傷組織誘導(dǎo)作用明顯，花藥在培養(yǎng)的前3d膨大明顯、生長快，呈淺綠色，表現(xiàn)較高的活性。當(dāng)2，4－D濃度為0.2mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)20％，白色愈傷組織生長快，色澤鮮艷。但達(dá)2.0mg/L時愈傷組織誘導(dǎo)率降低到10％，而4.0mg/L時無愈傷組織形成，花藥黃化體積變小，表明適當(dāng)濃度的2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)有利，

2.2.3 KT與NAA組合對花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響

KT與NAA配合使用結(jié)果表明，當(dāng)NAA為0.2mg/L，KT為2.0mg/L時有愈傷組織形成，但愈傷組織生長狀態(tài)較差，呈黃色(表2)，KT增至4.0mg/L愈傷組織呈白色(圖1a)，生長快，誘導(dǎo)率達(dá)11.7％，表明合適的KT與NAA比例可以誘導(dǎo)出質(zhì)量較好的愈傷組織。均無愈傷組織形成．表明2，4－D濃度過高對NAU—Dy－13—03愈傷組織誘導(dǎo)不利，即使添加KT也不可以改變這種負(fù)作用，因此2，4－D與KT配合使用對于蘿卜花藥愈傷組織誘導(dǎo)增效不明顯。

2.3 基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，5個不同基因型品系除NAU－Dy－13—03之外，其它4個品系在處理V與處理X中均有愈傷組織形成，并且處理V效果比處理X效果好，不同基因型對激素表現(xiàn)出相似反應(yīng)，對于NAU-Yb-03在處理XIV、XV與XVI表現(xiàn)出了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，但是在處理XV與處理Ⅵ中愈傷組織生長較慢、無光澤、呈黃色，生長狀態(tài)較差，因此不同基因型對激素反應(yīng)存在一定差異。

2.4 激素對愈傷繼代培養(yǎng)影響

在所有的繼代處理中，發(fā)現(xiàn)添加2，4-D愈傷組織生長停滯，呈現(xiàn)黃化現(xiàn)象，并且逐漸失去活力，表明2，4-D對愈傷組織的進(jìn)一步生長有抑制作用，當(dāng)繼代培養(yǎng)基中單獨(dú)添加2.0mg/L KT，愈傷組織同樣呈現(xiàn)黃色，不生長的現(xiàn)象；但當(dāng)KT達(dá)4.0mg/L時，愈傷組織均轉(zhuǎn)化為綠色(圖1b)，達(dá)6.0mg/L時，愈傷組織轉(zhuǎn)黃，逐漸失去活力，添加NAA對愈傷組織生長有重要影響，當(dāng)KT為4.0mg/L時，添加0.2mg/L或1.0mg/L NAA愈傷組織7 d體積可增加約一倍，但當(dāng)NAA達(dá)2.0mg/L時，愈傷組織生長速度減慢，根分化明顯(圖1c)，可見為使愈傷組織迅速增殖，KT與NAA配合施用是必要的。

3 討論

通過合適的培養(yǎng)方式獲得最佳的通氣與營養(yǎng)吸收環(huán)境是花藥培養(yǎng)獲得成功的重要方面，Phippen(1989)在進(jìn)行花椰菜愈傷組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)明顯好于液體培養(yǎng)，研究認(rèn)為通過固液雙層培養(yǎng)方式進(jìn)行花藥愈傷組織誘導(dǎo)能夠很好地解決營養(yǎng)與通氣的矛盾，更利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，本研究為了準(zhǔn)確探討激素對花藥愈傷組織的影響，在固液雙層培養(yǎng)中固體培養(yǎng)基未添加激素，但在合適的激素配比下同樣有愈傷組織的形成，且相對于固體培養(yǎng)能使花藥保持較長時間的綠色，表明固液雙層培養(yǎng)中液體培養(yǎng)基中的激素對于愈傷組織的誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用，當(dāng)花藥愈傷組織長到2mm之前及時轉(zhuǎn)移，液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)與激素足以愈傷組織生長所需，同時固體培養(yǎng)基富含的水分可以減緩液體培養(yǎng)基的揮發(fā)，使激素保持較高的活性狀態(tài)。

研究認(rèn)為激素在啟動細(xì)胞脫分化過程中有重要作用，其中生長素和細(xì)胞分裂素是兩類重要的調(diào)控激素，2，4-D作為一種重要的生長素對于愈傷組織誘導(dǎo)有較好效果，在某些作物上甚至是必需的，但是不同的作物所要求的濃度不同，HongChang等(1991)研究發(fā)現(xiàn)2.0mg/L的2，4-D與1.5mg/L的KT配合使用對玉米的花藥愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，Kiviharju等(1999)發(fā)現(xiàn)高濃度的2，4-D(5－6 mg/L)有利于燕麥胚胎的形成，本研究結(jié)果表明0.2mg/L的2，4-D對蘿卜花藥愈傷組織誘導(dǎo)頻率較高，高濃度2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)不利，且與KT配合使用效果不理想，且沒有2，4-D的情況下KT(4.0)+NAA(0.2)同樣也有較高的花藥愈傷組織形成，表明2，4-D對蘿卜花藥愈傷組織誘導(dǎo)有促進(jìn)作用但不是必需的。

基因型對花藥愈傷組織的形成有著重要的影響已在多種作物中得到了證實，本研究證實基因型效應(yīng)在蘿卜的花藥愈傷組織形成過程中也同樣存在，NAU-Dy-13-03品系對愈傷組織形成不敏感．在各種處理中始終未見芽的分化，2，4-D對愈傷組織的分化有一定的抑制作用，與Zhang等(2001)研究基本一致，NAA達(dá)2.0mg/L時有根的分化，祝仲純等(1980)通過蘿卜下胚軸進(jìn)行植株再生時發(fā)現(xiàn)愈傷組織先分化根，后分化芽，并且獲得了再生植株，因此關(guān)于蘿卜花藥愈傷組織的分化與芽的再生體系尚待進(jìn)一步研究。

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。