骨髓間充質干細胞復合組織工程化脫細胞真皮基質構建組織工程皮膚

[摘要]目的：體外培養擴增sD大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，復合組織工程化脫細胞真皮基質構建組織工程皮膚，為進一步-臨床應用奠定基礎。方法：將SD大鼠骨髓間充質干細胞進行體外培養擴增后，以生長狀態良好的骨髓間充質干細胞接種于制備好的組織工程化脫細胞真皮支架上，進行體外聯合培養，構建組織工程皮膚。觀察細胞生長情況及組織工程皮膚結構。結果：體外培養的SD大鼠骨髓間充質干細胞生長良好，傳代擴增容易，組織工程化脫細胞真皮基質去細胞完全，骨髓間充質干細胞在脫細胞真皮基質中生長良好，可體外構建組織工程皮膚。結論：利用體外擴增培養的骨髓間充質干細胞及制備的組織工程化脫細胞真皮基質可以體外聯合構建組織工程皮膚。

[關鍵詞]骨髓間充質干細胞；脫細胞真皮；組織工程皮膚

[中圖分類號]0813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1 008－6455(2007)04－0443－04

對于大面積皮膚缺損患者，盡早在功能和外觀上修復創面對降低病人的死亡率、提高病人的生存質量極為重要。但由于自體皮源不足和取皮本身又造成新的皮膚缺損等原因，限制了自體皮移植的應用。組織工程皮膚的研制和應用為大面積皮膚缺損患者帶來了福音，但也存在著種子細胞來源不足和理想的支架材料沒找到等問題。骨髓問充質干細胞是具有多項分化能力的成體干細胞，在皮膚創面微環境下，它可以分化為表皮細胞、成纖維細胞和血管內皮細胞，另外，它還可分泌多種生長因子，促進創面愈合，有望成為皮膚組織工程理想的種子細胞。組織工程化脫細胞真皮基質是一種新開發的組織工程支架材料，具有組織相容性好，適于組織再生等優點。本研究以骨髓間充質干細胞為種子細胞，以組織工程化脫細胞真皮為支架載體，體外聯合培養，以期構建組織工程皮膚。

1 材料和方法

1．1 材料：SD大鼠(第四軍醫大學實驗動物中心提供)，Percoll淋巴細胞分離液(1.073g/ml，購自美國Pharmacia公司)，DMEM－F12培養基(購自美國Sigma公司)，胰酶(購自美國Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青犢牛應用研究所)，超凈工作臺(Nuair)，CO₂孵箱(Nuair)，倒置顯微鏡(Olympus)

1．2 方法與步驟

1．2．1 組織工程化脫細胞真皮基質的制備：在無菌條件下，將BAM用醋酸溶液溶解后，加入1/10體積的胎牛血清和10X的DMEM培養基，調節pH值為7.2，加入培養的成纖維細胞，使終濃度為10⁶個細胞/ml，再將BAM—細胞懸液加至培養皿中，在37℃、5％CO²條件下固化30min，再加入器官培養液；每天換液，37℃條件下連續培養10天。取出培養好的組織工程化細胞外基質，PBS清洗后置于-80℃條件下反復凍融3次，每次30min，使細胞完全破裂崩解；最后將其置于冷凍干燥機內凍干。⁶⁰Co消毒，無菌封裝。取部分材料做組織學和掃描電鏡觀察，觀察組織工程化脫細胞真皮基質的顏色、結構、空隙分布、細胞殘留情況。

1．2．2 骨髓問充質干細胞的分離培養及擴增：取120-150g雄性SD大鼠(4周)，將大鼠斷頸處死，70％乙醇消毒，無菌條件下取股骨、脛骨，剔出周圍肌肉組織，剪去兩端骨骺，抽取5ml無血清DMEM—F12培養基(含青霉素、鏈霉素各100U/ml)沖洗骨髓腔，吹打制成單細胞懸液，注入含有5mlPercoll的分離液于離心管中，離心半徑8cm，2000r/min離心20min，收集離心液界面上乳白色云霧狀的細胞層，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10％胎牛血清的DMEM—F12培養基重懸細胞，計數5×10⁶個/ml后即接種于培養瓶中，置于37℃、5％CO₂、95％濕度的培養箱中進行原代培養，分別于1、3天半量換液，以后每3天全量換液1次。倒置相差顯微鏡觀察細胞培養全過程。待細胞長滿瓶底80％時進行傳代培養，以1×10⁴個/ml傳代。

1．2．3 復合骨髓問充質干細胞的組織工程皮膚的構建：取凍干、滅菌過的組織工程化脫細胞真皮基質，用DMEM—F12培養基浸潤12h，后把培養基吸干，置37℃孵箱中4h。取生長狀態良好的第3代的骨髓間充質干細胞，用胰酶消化成細胞懸液，800r/min離心5min，DMEM-F12重懸，以10⁵/cm₂的密度接種在自制的組織工程化脫細胞真皮基質上，培養體系為DMEM—F12培養基，補充10ml/L的胎牛血清，置37℃、5％CO₂、95％濕度的培養箱中培養，每2天換液一次，連續培養12天左右，倒置顯微鏡下連續觀察有無污染及細胞生長情況。

1．2．4 組織工程皮膚的檢測方法：構建的組織工程皮膚在體外培養12天后，取材，并行大體觀察，組織學觀察和掃描電鏡觀察，主要觀察組織工程皮膚的顏色、柔韌性、組織工程皮膚的結構、骨髓間充質干細胞與組織工程化脫細胞真皮的結合以及骨髓問充質干細胞在組織工程化脫細胞真皮基質中的生長、伸展狀況。

2 結果

2．1 組織工程化脫細胞真皮基質：大體觀察組織工程化脫細胞真皮基質呈乳白色，微泛紅色，柔韌，厚度為2500μm左右。HE染色顯示膠原呈無規則排列，存在大小不等的不規則腔隙，未見任何細胞碎片。掃描電鏡觀察在其表面和內部均有大量的宏觀孔隙，形態不一，分布較均勻，且孔與孔之間成三維連通結構，孔隙率較高。

2．2 骨髓間充質干細胞體外培養：原代培養的BMSCs于1天開始貼壁，細胞伸展成梭形、橢圓形或多角形；2天有細胞集落形成，貼壁細胞增多；4天呈典型的成纖維細胞形態；10天細胞集落逐漸擴大融合成單層。傳代細胞生長較原代快，6天即鋪滿培養瓶底，傳代細胞保持原代細胞的形態特征，隨著代數增加細胞得到純化，梭形細胞占95％以上。

2．3 組織工程皮膚的結構：骨髓問充質干細胞與組織工程化脫細胞基質共培養12天后，大體觀察組織工程皮膚柔軟，乳白色，隨形性好。在倒置顯微鏡下選擇透光性好的部位進行觀察，發現細胞在支架上呈梭形排列，生長良好。HE染色可見骨髓問充質干細胞在表面形成了有3-5層細胞的類表皮結構，在下層，骨髓問充質干細胞較均勻的生長在組織工程化脫細胞真皮基質中，形成類真皮結構。掃描電鏡觀察可見在表面的孔隙中有大量的細胞附著生長，細胞突起伸入四周孔隙。

3 討論

近年來，皮膚組織工程發展日新月異，國內外已有多項產品應用于臨床，并取得了一定療效，組織工程皮膚研制的根本問題就是三維支架材料和種子細胞問題，尋找合適的支架材料和理想的種子細胞是研制組織工程皮膚的關鍵。

自1995年，Livesey等首先報道制成脫細胞真皮基質(A1lograft dermal matrix，ADM)，Wain-wright行異體移植用于燒傷患者Ⅲ度創面的覆蓋取得成功以來，作為皮膚替代物的脫細胞真皮以其合理的結構，相對堅韌的機械性及良好的組織相容性受到越來越多學者的重視。1995年美國Life-cell公司生產的異體脫細胞真皮基質(Alloderm)在臨床已廣泛應用，成為較理想的真皮替代物。Takami等將大鼠的ADM異體移植，發現術后1-2周完全血管化并伴隨成纖維細胞的浸潤。脫細胞真皮依其材料和加工途徑可分為天然皮膚中獲取的脫細胞真皮和組織工程化的脫細胞真皮。脫細胞真皮去除了細胞成分，而保留了膠原成分，具有抗原性弱，生物相容性好，血管化速度快，可誘導自體組織細胞再生及減少瘢痕形成等優點。而組織工程化脫細胞真皮較天然的脫細胞真皮的最大優勢就是其ECM結構與天然結構接近，而組織相容性較天然的脫細胞真皮好，由于我們在制備組織工程化脫細胞真皮基質過程中，使用了人的成纖維細胞，在此過程中，牛皮來源的基質蛋白逐漸得到降解，而同時成纖維細胞自身又分泌了膠原基質，如果應用于臨床，這就在很大程度上降低了原來因不同種屬所引起的免疫排斥反應，且人的成纖維細胞體外培養擴增容易，利用本方法可以得到大量的組織工程化脫細胞真皮，將解決臨床上大量需要的問題。因此，它可作為一種良好的構建永久性皮膚替代物的真皮支架。種子細胞的研究是皮膚組織工程的基礎和前提。骨髓間充質干細胞是存在于骨髓基質內的非造血細胞來源的細胞亞群，屬成體干細胞，它們可以在體外經誘導后最終分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌管、神經細胞。最近研究表明，骨髓問充質干細胞可定向分化為皮膚的表皮細胞、皮脂腺、濾泡上皮細胞、樹突狀細胞；付小兵等研究證實自體移植的骨髓問充質干細胞可提高皮膚創面的修復質量。Yongbo Liu等用RT—PCR和ELISA等方法檢測了在創傷微環境作用下生長因子在BMSCs中的表達，顯示在創傷微環境作用下BMSCs可分泌TGF-β1、EGF、VEGF、PDGF、KGF、FGF、HGF等，而這些生長因子在創傷修復過程中起到關鍵的促進作用。另外，由于間充質干細胞取材相對簡單，體外培養擴增較容易，不存在倫理學的問題，如果采用自體移植的方法，還可以避免異種異體細胞的免疫排斥問題，因此，骨髓問充質干細胞可作為良好的皮膚組織工程的潛能種子細胞。

本實驗利用在組織工程化脫細胞真皮基質上接種骨髓問充質干細胞，探討構建組織工程皮膚的可能性。結果表明，骨髓間充質干細胞在脫細胞真皮中生長良好，組織工程化脫細胞真皮基質對培養的骨髓間充質干細胞無明顯的毒性作用。構建的組織工程皮膚HE染色可見表面形成了有3～5層細胞類表皮結構，下層細胞較均勻的分布在組織工程化脫細胞基質的孔隙中，形成類真皮結構。進一步，我們可以嘗試利用人自體的骨髓間充質干細胞和組織工程化脫細胞真皮基質復合構建組織工程皮膚，用于臨床皮膚大面積缺損的治療，期望提高創面愈合的速度和質量。但有報道表明，脫細胞真皮在應用中還是存在著不同程度的免疫排斥等問題，雖然我們用的組織工程化脫細胞真皮的抗原性比天然的脫細胞真皮小，但還是應該盡量降低它的抗原性，以更好地應用于臨床。另外，它的機械性能略差。因此，在脫細胞真皮研究中，要解決的主要問題是盡量降低其抗原性，并增加其機械性能。另一方面，骨髓問充質干細胞尚無或未找到其完全的特異性標志，所以目前對骨髓問充質干細胞的分離及特征性描述都是以一個細胞群體的形式進行，因此，進一步確定骨髓間充質干細胞特異的表面標志和研究更有效地分離純化骨髓問充質干細胞的方法是十分必要的。