體外誘導人臍血間充質干細胞向軟骨細胞分化的初步研究

[摘要]目的：探討人臍帶血間充質干細胞存在及體外向成軟骨細胞分化的可能性。方法：將無菌條件下采集健康產婦臍帶血，用相對密度為1.077g/m1的人淋巴細胞分離液分離臍血單個核細胞，利用間充質干細胞貼壁生長的特性獲得MSCs，流式細胞儀檢測其表面抗原標志。聯合應用TGF－β1和IGF－Ⅰ及含有1×ITS+I的高糖DMEM進行誘導培養，并于誘導前及誘導后第21天留取細胞，甲苯胺藍染色，免疫細胞化學法檢測Ⅱ型膠原的表達，分析是否誘導出成軟骨細胞。結果：臍血MSC強表達CD44、CD105，不表達CD34、CD45。誘導21天甲苯胺藍染色陽性，特異性表達Ⅱ型膠原。結論：人足月臍帶血中存在MSCs，在TGF-β1等生長因子誘導下可以向具有軟骨細胞表型和功能的細胞分化。

[關鍵詞]臍帶血；間充質干細胞；成軟骨細胞；轉化生長因子-β1

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2007)04-0450-05

臍帶血(human umbilical cord blood，HUCB)作為造血干細胞的來源，能夠替代骨髓移植來治療多種疾病，但是在臍血中是否含有間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)仍存在爭議。其中間充質成分的鑒定仍然不明。為此，本實驗探討其存在可能性及向軟骨分化的潛能。

1 材料

1．1 標本：在無菌條件下采集于健康育齡產婦足月自然分娩的臍帶血40－60ml。經檢測均未發現急慢性傳染性疾病和感染性疾病，無家族性疾病，新生兒無畸形。所采集樣本肝素抗凝(25U/m1)。

1．2 試劑：α－MEM、FBS及高糖DMEM(Gibco公司)、人淋巴細胞分離液(天津TBD)、鼠抗人CD34－FITC、CD44-FITC、CD45－FITC、CDl05－PE(BD公司)、TGF－β1、IGF—I(Peprotech公司)、ITS+1(Sigma公司)、鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體(福州邁新)、SP奧抗試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中衫)

1．3 耗材和儀器：培養板、培養瓶(Corning)、流式細胞儀(BD公司)、相差倒置顯微鏡(Olympus)

2 方法

2．1 臍血單個核細胞的分離、培養：將所采集臍血樣本于12h內處理。用D—Hank’s緩沖液1:1等比稀釋，再與37℃預溫的3％明膠等比混合，室溫下靜置至血漿與紅細胞界面形成后，吸取血漿層，離心，收集細胞；用5mlα-MEM重懸所得細胞，按2：1的體積比加到人淋巴細胞分離液(1.077g/m1)表面，離心后吸取懸于分離液面的白膜層，獲得單個核細胞。D—Hank’s緩沖液洗滌2次，加入α—MEM(含20％FBS、IOOU/ml青霉素、100U/ml鏈霉素)培養基，吹打均勻制成單細胞懸液，計數，以1×10⁶cells/ml濃度接種于一次性塑料培養瓶中，置于37℃，5％CO₂，飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。4天后首次換液，去除未貼壁的細胞，以后每隔3天換液一次。在相差倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。細胞生長至60％時，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA消化，1：1傳代。第一代后細胞生長達到80％-90％時，按1：3傳代。

2．2 臍血MSCs生物學特性檢測

2．2．1 臍血問充質干細胞的凍存和復蘇：將生長情況良好的P3代細胞用消化液消化成單細胞懸液，洗滌，離心，收集細胞沉淀，用含有10％DMSO的凍存液重懸細胞，調細胞密度至5×10⁶/ml。無菌的凍存管分裝，封口。置于70℃冰箱中，3h后，取出凍存管移入液氮容器內。復蘇：細胞凍存3個月后，將凍存管從液氮中取出，迅速放入40℃的水浴中，搖動，1-2min內解凍，復蘇，洗滌后，加入新鮮的培養液，調整細胞濃度，接種，置37℃恒溫培養箱中培養。

2．2．2 臍血MSCs生長曲線的檢測：接種細胞分為兩組：①凍存組：同一樣本來源的凍存細胞；②對照組：取生長良好的P3細胞。調節細胞濃度，以1×10⁴cells/ml濃度，接種于24孔培養板中，每孔1.0ml，24h后換液，去除未貼壁的細胞。每天取6孔消化，每孔計數3次，求均值。連續8天。未測者應及時換液。以培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，描繪生長曲線。并定期觀察細胞生長情況，包括形態特點，細胞到達平臺期即停止觀察。

2．3 臍血MSCs表面抗原的檢測：取生長狀態良好的P3代細胞，在細胞達到80-90％融合時，用0.25％胰蛋白酶/0.01％EDTA的消化液消化細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×10⁶ells/ml。分別加入鼠抗人CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE單克隆抗體，陰性對照管中分別加入抗鼠IG—PE、IG—FITC，孵育20min。加入3ml PBS，洗滌2次，溶于200ul PBS中。流式細胞儀進行檢測。

2．4 臍血MSCs向軟骨細胞誘導：取P3代生長良好的培養細胞，以1×10⁵cells/ml濃度接種于培養瓶中，加入α—MEM(含20％FBS、100U/ml青霉素、100u/ml鏈霉素)培養基。過夜后更換為高糖DMEM含血清軟骨誘導液進行單層細胞誘導培養。所用的軟骨細胞誘導液含有：5％FBS，10ng/mlTGF—β1(human recombinant)，10ng/mlIGF—I(human recomb-inant)，0.1ml地塞米松，50μg/ml抗壞血酸，1×ITS+I。同時以未誘導MSCs作為對照。培養細胞每2天換液一次。在誘導21天后，消化誘導的細胞，接種于細胞爬片上，進行相應檢測。

2．5 鑒定

2．5．1 甲苯胺藍染色：待細胞貼壁伸展后，將細胞爬片取出，4％多聚甲醛固定1h，自來水沖洗15min，蒸餾水沖洗1次，置細胞爬片于1％甲苯胺藍染液中，2h后，蒸餾水沖洗1遍，在用95％乙醇洗去多余的染液。光鏡下觀察細胞染色情況，干燥爬片，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2．5．2 Ⅱ型膠原免疫組化染色：取培養21天的誘導細胞爬片，用4％多聚甲醛固定1h，PBS沖洗3次。滴加過氧化物酶阻斷溶液以消除內源性過氧化物酶，室溫孵育10min，PBS沖洗3次，加入正常山羊血清以封閉非特異性結合位點，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。于玻片上分別滴加一抗，以PBS作為陰性對照，置濕盒內，4℃冰箱過夜；爬片室溫復溫1h，PBS沖洗3次。再依次滴加生物素標記的二抗及鏈霉菌素一過氧化物酶溶液，37℃孵育30min，PBS沖洗3次。除去PBS后，于玻片上滴加1滴DAB顯色劑，在光鏡下觀察染色情況，以陽性反應著色最強而背景開始染色為度，自來水沖洗。系列酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。其中以PBS代替一抗樣本作為空白對照。

3 結果

3．1 臍血間充質干細胞的分離與擴增

3．1．1 MSC的原代培養：將臍血分離后獲得的單個核細胞接種于一次性塑料培養瓶，48h后可見貼壁細胞出現，這些細胞在形態上呈現非均一性，有大而多核的破骨樣細胞和呈紡錘形或長梭形的成纖維樣細胞。隨著培養時間的延長，貼壁細胞增多。經過約3周的培養，成纖維樣細胞增殖可達約60％融合，細胞排列有一定方向性。

3．1．2 臍血MSC傳代培養：原代貼壁細胞長成60％融合后，用0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，1：1傳代。細胞在接種后呈圓形，折光性好。2h后開始貼壁，12h后貼壁細胞可達到90％以上，并逐漸伸展；傳代后細胞均勻散在分布，生長迅速，不再形成集落；接種2天后即開始增殖，約10天左右可達到80％融合。隨著進一步的傳代過程，其他細胞逐漸被去除，貼壁細胞呈均一的長梭形，增殖加快，1周左右即可達80％-90％融合。

3．1．3 傳代MSC的生長曲線：傳代的P3代細胞和凍存復蘇后的P3代細胞相比較，凍存組細胞的細胞活性和增殖能力均較未凍存細胞略有降低。凍存組細胞在復蘇后，細胞數量有所減少。生長曲線顯示，凍存組細胞潛伏期增長，但在第4天其增殖能力開始恢復，生長速度加快，倍增時間和未凍存組相比沒有差異。

3．2 臍血MSCs表面標志的檢測：MSCs經鼠抗人CD34、CD44、CD45、CDl05單克隆抗體標記后檢測的結果為：人臍血MSCs第3代細胞表面抗原不表達造血細胞相關抗原CD45、CD34，而CD44、CDl05呈現陽性表達。

3．3 臍血MSC向軟骨細胞誘導：在誘導初期，誘導組與對照組相比，細胞形態上無明顯差異；誘導1周后，誘導組細胞伸展的胞突開始縮短，胞體鋪開變大，細胞逐漸向多邊形或類三角形轉變。誘導21天后，臍血MSCs經甲苯胺藍染色后胞漿呈現藍色異染顆粒。誘導后臍血MSCa呈現黃褐色染色。

4 討論

目前，成體干細胞中的骨髓問充質干細胞得到了大家的認可，其間充質分化潛能甚至在體外重復傳代后仍然保持，被認為是MSCs的一種主要來源。與骨髓相比，臍血有更充足的來源，其收集過程比從骨髓或胚胎獲取干細胞簡單，臍血中含有MSCs更為原始，具有更強的分化能力：臍血的免疫原性較弱，能耐受更大程度上的HLA配型不符，故臍血中的MSCs可以作為一種新的替代干細胞的來源而用于多種系統疾病的細胞移植治療。

自Erices報道從臍血中分離出MSCs以來，越來越多的學者也相繼證實了人臍血問充質干細胞的存在，并且在體外實驗中驗證了臍血MSCs的多向分化潛能，但是也有學者質疑在臍血中不存在MSCs，或者在足月嬰兒的臍帶血中不存在。本實驗利用密度梯度離心法與自然沉降法相結合的方法，成功從足月嬰兒臍帶血中分離出了MSCs。在原代培養中，貼壁細胞表現兩種細胞形態，即破骨細胞樣和成纖維樣細胞，這和Erices報道的結果相似。在傳代培養中，破骨樣細胞不能增殖逐漸被去除，所分離的細胞能夠得到純化，表現為形態均一的成纖維樣細胞。在實驗中我們發現，部分樣本未分離出了MSCs，這可能和足月臍血中所含的MSCs頻度較低和其活性受到不同分離培養條件的影響有關，所以，臍血MSCs分離方法還有待于進一步的探索和完善。

在本實驗中我們觀察到，臍血MSCs在傳代后增殖速度加快，在7天左右即可達到融合狀態，表明足月生產的臍帶血MSCs亦有很強的增殖能力。而且，通過生長曲線的觀察，MSCs在凍存后，生長潛伏期略有延長，可能由于細胞凍存和復蘇過程對細胞活性有一定程度的影響，但可以迅速恢復原有的增殖能力。

臍血MSCs表達的主要分子包括：①粘附分子：CD13、CD44、CD51、CD54；②整合素家族：CD29、CD49b、CD49e；以及SH2(CD105)、SH3(CD106、VCAM-1)、SH4、ASMA、HLA-ABC等。陰性標志：造血細胞的表面標志，如：CD34、CD45、CD14、CD19(B細胞特異的抗原)、CD38以及共刺激分子B7—1、B7—2(HLA識別相關)、HLA—DR抗原等。其中，CD34是主要的造血干/祖細胞標志物；CD45是位于白細胞表面的白細胞共同抗原，表達在淋巴細胞以及除了紅細胞和血小板之外的其它所有的造血細胞上。臍血源性MSCs一般不表達白細胞共同抗原(CD45)和造血干細胞標志物CD34，是作為MSCs有別于造血細胞的一個重要基本特征。本實驗中流式細胞儀檢測提示所分離培養的成纖維樣細胞表達CD44、CDl05(SH2)，不表達造血細胞相關抗原CD34、CD45，證明這些細胞是一群區別于造血細胞的具有高度增殖能力的處于分化狀態的一類非定向祖細胞，同時亦說明在足月臍帶血中存在有MSCs。

甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組化檢測結果表明，足月臍帶血MSCs在體外成軟骨誘導因子的作用下，能夠向間質組織細胞分化。在以往臍血MSCs向成軟骨分化的研究中，多采用細胞微團培養法進行誘導，可能是認為在三維培養的條件下，可能更利于細胞之間信號的傳遞和細胞因子的相互作用。但僅靠這種微團培養的方法并不能得到較多的組織量，如果進行較大的微團誘導則可能會因細胞營養等原因影響團塊中央細胞的生長分化，甚至出現壞死。在體外誘導培養中，細胞單層狀態下則不存在這個問題，而且可以得到更多的細胞量目前，單層誘導MSCs向軟骨誘導分化的研究僅限于骨髓Mscs，在臍血中尚未見報道。本實驗證實了人足月臍帶血MSCs向軟骨細胞分化的潛能。

在透明軟骨細胞的胞外基質中，Ⅱ型膠原是軟骨細胞特征性標志。本實驗用免疫組化法證實了人臍帶血MSCs在單層誘導后分泌的軟骨細胞特征性的細胞外基質Ⅱ型膠原的表達，表明了HUCB MSCs的可塑性。在誘導分化培養中，我們觀察到，在無血清誘導培養中，細胞生長狀態不佳，增殖緩慢；所以，我們在采用了低血清誘導體系，應用TGF—β1、TGF—Ⅰ聯合誘導臍血MSCs的分化。

有研究發現用TGF—β1和地塞米松對MSCs誘導后，可檢測到異染性物質的存在，Ⅱ型膠原的mRNA表達，顯示TGF-β1在誘導MSC向軟骨方向分化的過程中起重要作用。TGF-β1在單獨作用下，可以誘導MSCs向軟骨細胞分化，而在與其他生長因子聯合作用下，則更利于細胞的定向分化。Worster體外培養BMSCs觀察到，用單純TGF—β1或單純IGF-1預先誘導的BMSCs軟骨相關標志物的表達比較弱，用TGF—β1預處理并添加了IGF—1的培養液，BMSCs成軟骨的能力明顯增強。說明TGF-β1與IGF-Ⅰ有協同作用，在TGF-β在其他生長因子共同作用下，可增強其對MSCs的誘導作用。誘導液中加入地塞米松，可抑制MSCs向脂肪細胞分化，本實驗在誘導液中加入IGF—Ⅰ、地塞米松和抗壞血酸，增大誘導成軟骨效應，抵消成骨效應，獲得較大的促增殖和成軟骨效應。

本研究證實了人足月臍帶中存在MSCs，且可在體外進行分離、培養、擴增傳代，其表型與骨髓源性MSCs一致，并能在單層狀態下誘導分化為成軟骨細胞，驗證了其分化潛能，為進一步在體外結合支架材料構建組織工程軟骨提供了實驗基礎。