ＶＥＧＦ在犬恒牙胚發育中的表達及意義

[摘要]目的：探討犬乳恒牙替換過程中血管內皮生長因子(VEGF)在犬恒牙胚發育中的表達及意義。方法：分別對乳牙期、替牙期、恒牙期本地犬取牙胚及其周圍組織，制備石蠟切片，進行HE染色和牙胚內VEGF的免疫組化染色，用彩色病理圖像分析系統分析各組染色強度灰度值。結果：乳牙期、替牙期犬牙胚的成牙本質細胞VEGF的免疫組化強度明顯高于另外一組，成釉細胞中也有陽性信號。結論：VEGF可能參與恒牙胚的發育。

[關鍵詞]犬恒牙胚；血管內皮生長因子；成牙本質細胞；成釉細胞

[中圖分類號]R780.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—6455(2007)04—0510—02

血管內皮生長因子(Vascular EndothelialGrowth Factor，VEGF)是由血小板、巨核細胞、內皮細胞和成骨細胞或腫瘤細胞合成和分泌的多功能細胞素，具有促進內皮細胞增殖、血管生成、增加血管通透性以及血管維持等功能。許多研究表明，VEGF在胚胎發育過程中協調著細胞外基質的改建、血管增生的關系。而在恒牙胚發育中的作用卻未見相關報道。本實驗主要通過對犬恒牙胚成牙本質細胞中VEGF的表達進行研究，探討VEGF在此過程中的作用。

1 材料和方法

1．1 材料及分組：動物選用本地犬共6只，分為3組，每組各2只。A組：乳牙牙根穩定犬(6周齡)，體重2.5Kg；B組：乳牙牙根吸收犬(12～16周齡)，體重6Kg；C組：成年恒牙列犬(20周齡)，體重10Kg。

1．2 試劑：兔抗鼠和人VEGF多克隆抗體(SantaCruz公司，美國)；SABC免疫組化檢測試劑盒(北京中杉)；DAB顯色試劑盒(北京中杉)。

1．3 切片標本制作及觀察：分別將實驗犬以速眠新Ⅱ注射液按0.2ml/Kg肌注麻醉，解剖分離雙側頸動脈后斷頭處死，頸動脈插管，用生理鹽水沖洗，4％甲醛固定液(含1/1000 DEPC)進行灌注組織內固定，分離上、下頜骨，4％甲醛固定液外固定24h，上、下頜骨于甲酸、甲酸鈉脫鈣液中4℃脫鈣，4周后分切成小塊，再脫鈣4周。脫鈣后，分切、修整、酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，制作5μm厚石蠟切片。石蠟切片脫蠟至水，常規HF染色，每只犬取5張切片共30張，每張切片光學顯微鏡下觀察根尖組織。

1．4 免疫組化染色及圖像分析：切片脫蠟至水，一抗為兔源性抗體，稀釋度1：80，其余步驟按試劑盒進行。用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統分析染色強度的灰度值，每個時期10張切片，每張切片隨機選取4個成牙本質細胞進行測量。

2 結果

A組：8周犬乳牙根未發生生理性根吸收，恒牙胚牙冠發育處于牙體組織形成期，牙本質、牙釉質基質開始形成。成釉細胞、成牙本質細胞高柱狀，胞核橢圓形，遠離基底膜，整齊排列，極性倒置明顯。此時可見恒牙胚內成牙本質細胞及成釉細胞染色陽性，染棕黃色?？瞻讓φ战M染色陰性。B組：12～16周犬乳牙根發生生理性吸收，恒牙胚冠部牙本質、牙釉質進一步形成和礦化，成釉器萎縮、上皮根鞘向根方生長，形成上皮隔，并可見上皮根鞘發生斷裂。此時恒牙胚內成牙本質細胞及成釉細胞染色陽性，空白對照組染色陰性。C組：20周成年犬恒牙列，乳牙已脫落，恒牙萌出。恒牙成牙本質細胞染色陰性。

經彩色病理圖像分析系統分析，成牙本質細胞染色灰度值分析見表1。

經LSD檢驗，A、B組與C組間P＜0.05，即成牙本質細胞免疫組化染色強度A、B組與C組間有顯著性差異，說明成牙本質細胞表達VEGF的強度不同。A組與B組間P＞0.05，即成牙本質細胞免疫組化染色強度A組與B組間無顯著性差異。

3 討論

VEGF的研究始于1989年，VEGF是一種由亞基內及亞基間二硫鍵交聯形成的同源二聚體糖蛋白。目前已發現VEGF家族至少包括五大成員：VEGF—A、VEGF—B、VEGF－C、VEGF-D并口PGF(placentalgrowth factor，胎盤生長因子)，分別定位于不同的染色體。目前已知VEGF家族有3個受體：VEGFR—1、VEGFR—2、VEGFR－3，分別由f1t—1、f1k—1/KDR、f1t一4基因編碼。其共同特點是催化域內有酪氨酸激酶插入區，酪氨酸激酶的活性通過受體和配體結合而激活，由受體磷酸化而刺激蛋白酶和Ca離子內流，對細胞的生長和分化起重要作用。

研究表明，VEGF是內皮細胞特異性最強的絲裂原，具有特異性促進血管增殖的作用。在牙齒發育早期，內皮細胞分泌VEGF促進血管形成。大量血管侵入牙乳頭、牙囊，以保證組織形成所需的營養。Aida研究表明，VEGF表達于內、外釉上皮及星網層細胞，調控成釉細胞的成熟。當成釉細胞成熟后，對牙乳頭發生誘導作用，分化為成牙本質細胞。成熟后的成牙本質細胞已具備合成蛋白質的功能。本實驗也發現：VEGF的陽性信號出現于發育中的恒牙胚成牙本質細胞、成釉細胞中，鏡下觀察，兩類細胞高柱狀，細胞核大、橢圓形，遠離基底膜，這種細胞形態學特點反映其功能和狀態正處于活躍的基質分泌期；恒牙萌出后，其成牙本質細胞成為扁平狀，說明其功能處于靜止，染色結果為陰性。圖像分析的結果A、B兩組間灰度值稍有不同，但相差不顯著，提示牙胚發育期間，細胞的功能狀態可能差別不明顯，但A、B組與C組則有顯著性差異，說明恒牙萌出后，成牙本質細胞VEGF染色強度明顯減弱，提示VEGF可能參與了牙胚的形成和發育，推測可能與硬組織礦化有關。