納米微囊－ＶＥＧＦ復合體對創傷組織中ＶＥＧＦ、受體ＫＤＲ的表達及微血管形成的影響

[摘要]目的：研究納米微囊－VEGF復合體對創傷組織中VEGF、受體KDR以及微血管表達的影響，探討其促進損傷組織修復的作用機理。方法：將納米微囊－VEGF復合體作用于兔耳慢性創面，利用反轉錄PCR方法觀察各組術后1、3、7、10、14天創面組織中VEGF及KDR mRNA表達的變化；利用免疫組化染色觀察創面肉芽組織中VEGF蛋白表達及微血管的變化。結果：VEGF mRNA在Nw(非缺血創面組)和CW+VEGF組(轉基因組)3天后的表達水平均高于其在CW組(慢性創面組)相應時間點的表達水平，P＜0.05；KDR mRNA在NW組7－14天，CW+VEGF組3－14天的表達水平高于CW組，P＜0.05；VEGF蛋白表達變化與mRNA表達結果基本一致；與CW組相比，7天后微血管計數在CW+VEGF組及NW組增加顯著，P＜0.05。結論：外源性VEGF基因轉染導致創面中VEGF及受體KDR的表達上調，并通過增加肉芽組織中微血管的生成促進了慢性創面的愈合。

[關鍵詞]血管內皮生長因子；基因治療；納米微囊

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008—645 5(2 007)04—0455—04

血管內皮生長因子(vascular endothelia1growth factor，VEGF)是血管生成的一個關鍵調節因素，慢性創面中VEGF表達較正常創面下調而導致的血管生成的下降，被認為是慢性創面難愈合的重要原因。在外源性VEGF的應用中，蛋白注入給藥方式由于存在價格昂貴、半衰期短、易水解和單次較大劑量使用可能會導致血流動力學改變等缺點，具有明顯的局限性。

本實驗采用新型材料納米微囊為載體包裹VEGF質粒，通過基因轉染方式促進慢性創面的愈合，并從蛋白及mRNA水平對創面VEGF、受體KDR的表達情況以及轉基因后它們的表達變化進行了分析，對其作用機理進行探討，為臨床治療慢性創面提供新的思路和理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料：VEGF、CD34單克隆抗體 (美國SantaCruz)；DEPC、APES膠、溴化乙錠、BSA(美國Sigma)；Trlzol試劑(英國GIBCO)；DTT、M-MLV反轉錄酶、RNase抑制劑(美國Invitrogen)；PCR試劑盒(日本Kakara)；DAKO Envision?System試劑盒(丹麥DAKO)；DNA分子量Marker DL2000(日本Kakara)。引物均由上海Sangon公司合成：VEGF上游引物：5’TGC TGC TCT ACC TCC ACC AT3’，下游引物：5’TTG GTC TGC ATT CAC ATT TG3’。KDR上游引物：5’GCC GGT GCC CTG TGC TTT CC3’，下游引物：5’TCC CCT GCA AGT AAT CTG AA3’。β-actin上游引物：5’GAG GCC CAG AGC AAG AGAGG3’，下游引物：5’CCA GAG GCA TAC AGG GACAA3’。

1．2 納米微囊－VEGF復合體的制備：參照彭湃、韓巖等報道方法制備。

1．3 模型制作及取材：健康新西蘭白兔25只，48－60月齡，體重3.9－5.0kg(第四軍醫大學實驗動物中心提供)，動物模型構建及分組詳見以往報道。據此將本實驗共分為3組：轉基因組(一側兔耳慢性創面滴加納米微囊VEGF復合體，以CW+VEGF表示)、慢性創面組(另側兔耳慢性創面滴加納米微囊空載質粒，以CW表示)、非缺血創面組(雙側兔耳非缺血創面滴加納米微囊一空載質粒，以NW表示)。于術后1、3、7、10、14天，每時間點隨機處死5只動物。取材方式：半數創面切取1cm×1cm正方形組織塊，中性福爾馬林固定、石蠟包埋。其余創面用直徑7mm的皮膚打孔器，在耳軟骨表面環形切取創緣皮膚及肉芽組織，每創面取100mg組織迅速放入-70℃冰箱中保存，用于RT—PCR。

1．4 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)：利用TRIzol試劑盒按說明提取組織總RNA。反轉錄酶合成單鏈cDNA。以93℃ 1min，適合的退火溫度30s，72℃1min，進行30個循環；72℃延伸8min，30個熱循環的程序進行PCR擴增。擴增產物經電泳、染色、凝膠成像系統檢測后，用Labworks軟件對各陽性條帶的密度進行測定。

1．5 VEGF、CD34免疫組織化學染色：石蠟切片常規免疫組化染色。其中一抗為VEGF、CD34單克隆抗體，稀釋度分別為1：50和1：100，同時設立已知陽性對照、陰性對照、空白對照、正常未免疫小鼠血清替代對照。

1．6 創面微血管計數：孤立的棕色血管內皮細胞或細胞簇代表l條單獨的微血管。根據Pareek等的計數方法，先在低倍(100X)視野內選擇染色密度高的區域，然后在高倍(200X)視野內計數3個視野，取平均值作統計學處理。

1．7 圖像分析：先在低倍鏡(100X)下篩選出染色較強的區域，然后在其中隨機選取5個高倍視野(200X)，LaicaQC500圖像分析儀測定其透光度，值越小，則染色密度越高。取平均值，設定染色背底的透光度為100，陽性染色的密度與背底密度的比值作為每張切片免疫組化染色的相對密度。

1．8 統計學處理：所得數據采用SPSS10.0統計軟件對數據進行ANOVA和post—hoc檢驗，分析組間和兩兩差異，顯著性差異標準α為0.05。

2 結果

2．1 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)結果：VEGFmRNA在NW和CW+VEGF組3天后的表達水平均高于其在CW組相應時間點的表達水平，具有統計學意義，P＜0.05。KDR mRNA在NW組7-14天，CW+VEGF組3-14天的表達水平顯著高于CW組，P＜0.05。

2．2 VEGF免疫組化染色結果：VEGF在創緣主要表達于新生表皮層，炎細胞有少量表達，3天后血管內皮細胞及成纖維細胞陽性信號逐漸增強，陽性顆粒定位于胞漿。在CW+VEGF組及NW組表達較強，而CW組陽性信號較弱。圖像分析結果見圖5，CW組雖然隨時間的延續表達上調，但曲線變化較平緩，其數值顯著低于其他兩組，P＜0.05。NW組3天后表達增高，7-10天達到峰值。CW+VEGF組自1天后表達升高明顯，7天時達到峰值。

2．3 創面微血管計數結果：CD34染色顯示7天后CW+VEGF組及NW組微血管數量豐富，而CW組微血管數量較少。計數結果表明，從1-14天各組微血管數量逐漸增加，在7天后CW+VEGF組及NW組與CW組之間的差異具有統計學意義，P＜0.05。

3 討論

在影響慢性創面形成的諸多因素中，內源性生長因子的嚴重匱乏是導致慢性創面難愈合的一個重要原因。在急性創面有數種促進愈合的生長因子的高水平表達，而慢性創面中會明顯減弱甚至缺失。Cooper證實在褥瘡創面中PDGF、bFGF、EGF和TGF-B表達水平明顯低于急性創面。同樣，在受損創傷愈合鼠模型中PDGF及其受體表達也下調。許多證據表明VEGF在創傷愈合中的表達水平與創傷修復的發展及預后有著密切的關聯。對大鼠創傷皮膚內VEGF表達的免疫組化研究表明，創傷組于傷后12hVEGF表達開始增強，以24-48h表達最強。對放射性潰瘍的研究證實，輻射損傷的皮膚組織細胞合成分泌VEGF的功能在潰瘍形成前被電離輻射輕度激活，在潰瘍形成后，VEGF蛋白表達水平明顯低于正常創面組，是潰瘍形成、發展及難愈合的原因之一。

從我們前期實驗中證實非病毒載體納米微囊-VEGF復合體能明顯促進慢性創面愈合。在本實驗中，慢性創面組VEGF雖然隨著時間的延續表達上調，但數值顯著低于其他兩組，說明在慢性創面中VEGF低表達可能是導致創面難愈合的一個重要原因。非缺血創面自3天以后VEGF表達顯著增高，7天至10天達到峰值，14天時仍維持較高水平，這有助于新生血管化，可能是該組創面能夠正常愈合的一個重要保證。外源性VEGF基因轉染創緣細胞后，表達在1天后顯著上調，可以推斷動物體內轉染成功。

VEGF的調控機制并不十分清楚。缺氧導致VEGF表達增高與其激活VEGF基因啟動子AP-1區有關，由于創面形成會造成不同程度的組織氧分壓下降，因此本實驗中各組均可能因創傷后局部低氧而上調VEGF表達。同時一些細胞因子對VEGF表達有正調節作用，而創傷修復各階段均有上述因子的表達?？梢酝茰y多種細胞因子可能通過激活某種特定的信號通路而影響VEGF的轉錄及翻譯過程。慢性創面多種生長因子表達的減弱甚至缺失而下調了VEGF的表達，使其表達曲線與非缺血創面差異顯著。

實驗選擇KDR作為受體研究對象，是因為Flt-1與VEGF有高度親和力，但其表達水平較低，不易檢測。在創傷形成后三組KDRmRNA表達水平都有不同程度提高，但提高的幅度是有明顯差異的，其中慢性創面提高幅度最小，而轉基因組上升幅度最大。KDR出現與VEGF一致性的表達升高更有利于兩者充分的結合而發揮其生物學效應，比如可以增強血管發生信號在內皮細胞的傳遞，進一步促進血管生成，有利于創面愈合的進程。

綜上所述，外源性VEGF基因轉染可以使創面中VEGF及受體KDR的表達上調，并通過增加肉芽組織中微血管的生成促進創面的愈合。但尚有一些問題值得深入探討，如外源性VEGF上調KDR表達是在何種水平通過何種信號傳導通路需待進一步的研究。