ＤＯＣ－１基因的原核表達載體構建及其重組蛋白的表達純化

[摘要]目的：克隆DOC一1基因、構建原核表達載體并純化出其重組蛋白。方法：從人胎腦組織中提取總RNA，經逆轉錄－聚合酶鏈式反應(RT—PCR)擴增DOC－1的CDS序列，再通過基因重組技術將該基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1載體中，構建融合表達載體pGEX-4T-1-DOC-1，經酶切、測序鑒定后，用該重組質粒轉化E.coliBL21，用IPTG誘導表達，OlutathioneSepharose 4B柱親和層析純化重組蛋白。結果：電泳證實RT-PCR擴增產物與預期目的基因DOC－1長度一致，測序結果與GenBank公布的DOC－1基因序列完全一致，IPTG誘導后經SDS—PAGE電泳分析表明，在相對分子質量38000左右出現新的蛋白表達條帶，經親和層析柱純化后得到高純度的GST-p12重組蛋白。結論：成功構建了pGEX-4T-1－DOC－1原核表達載體，表達并純化出GST－p12重紐蛋白，為進一步研究p12^DOC-1蛋白打下了實驗基礎。

[關鍵詞]p12^DOC-1；蛋白；口腔癌缺失；基因克?。换虮磉_

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)04—0447—03

癌癥作為一類嚴重威脅人類生命的疾病，已成為醫學研究關注的重要課題。口腔癌和身體其他部位癌一樣，其發生、發展亦涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活。DOC－1基因是Todd等(1995)利用敘利亞倉鼠口腔頰癌模型分離的正常和惡性角化細胞進行細胞雜交實驗分離和證實的一個候選抑癌基因，作為一個候選抑癌基因它具有以下幾個特點：惡性角化細胞雜合性缺失；與正常上皮相比惡性上皮中DOC－1表達降低；DOC－1的轉入抑制腫瘤細胞的生長；經轉染DOC－1 cDNA的惡性角化細胞在動物模型中逆轉了惡性表型。p12蛋白作為其編碼的蛋白因子，具有抑制DNA復制，從而抑制惡性角化細胞的生長，使其表型改變的功能，近來已逐漸成為研究的熱點。為了開展對DOC－1的研究，進一步了解其功能及其在口腔鱗狀細胞癌中表達缺失機制中的作用，本實驗通過RT—PCR獲得DOC－1的eDNA編碼區序列，并且構建了其克隆表達載體，在大腸桿菌中實現了p12^DOC－1重組蛋白的高表達，為以后的工作打下了實驗基礎。

1 材料

1．1 質粒、菌株和標本：pMD18-T和pGEX-4T-l載體質粒、E.coli (DH5 a和BL21)、7個月的人胚胎腦組織，均由中科院遺傳與發育生物學研究所戴建武實驗室惠贈。

1．2 工具酶和試劑盒：各種限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、T載體試劑盒、TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、O1igo(dT)均購自Takara公司，IOObpDNA ladder marker購自北京天為時代生物公司，蛋白分子量marker購自fermentas公司?？俁NA提取試劑盒TRIZOL購自Invitrogen公司。質粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒均購自OMEGA公司。

1．3 試劑及引物合成：一般化學試劑均為國產分析純，Glutathione Sepharose 4B購自AmershamBiosciences公司。PCR引物合成及測序均由上海生工生物技術有限公司完成。

2 方法

2．1 RT—PCR擴增DOC－1基因及基因重組與鑒定：按TRIZOL試劑盒說明提取7個月人胚胎的腦組織的總RNA，先反轉錄為cDNA，再以此為模板進行PCR，上下游引物分別為5’ATGTCTTACAAACCGAACTTGGCC3’和5’CTAGGATCTGGCATTCCGTTC 3’。反應體系共25μl，擴增程序：94℃ 5min；94℃ 40s；56℃ 40s；72℃ 50s；共循環34次；最后在72℃維持10min。取5μl反應產物進行1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴增產物；回收相應大小的PCR產物后與pMDl8-T載體連接，轉化大腸桿菌(DH5a)感受態細胞，構建pMDl8-T-DOC-1載體質粒。用菌落PCR進行初步鑒定，將能擴增出目的基因片段的質粒送上海生物工程公司測序。

2．2 原核表達載體pGEX-4T-1-DOC-1的構建：以測序后含DOC-1編碼區序列的質粒為模板，在前一對引物的基礎上再分別設計含酶切位點的上下游引物分別為5’CGCCGGTCCATGTCTTACAAACCG3’和5’CCGCTCGAGCTAGGATCTGGCATT3’，其中上游含BamH Ⅰ酶切位點，下游含Xho Ⅰ酶切位點，擴增含有酶切位點的DOC-1編碼區序列。回收并純化PCR產物后用BaraH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，表達載體pGEX-4T-1也用同樣的酶消化后回收并純化。將兩種雙酶切后的產物進行連接，轉化到大腸桿菌(DH5 α)中，然后用雙酶切鑒定并再次測序，得到重組的表達質粒pGEX-4T-1-DOc-1。

2．3 重組蛋白的原核表達：將含pGEX-4T-1-DOC-1的質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，挑選陽性的單克隆菌落接種到含AMP⁺的LB培養基中，在37℃的搖床培養過夜，次日將培養的菌液按1:50的比例加入到新的含AMP⁺的IJR培養基中繼續在37℃的搖床培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，在37℃搖床進行誘導表達2h、3h、4h，不加IPTG的作為陰性對照。離心收集菌體，超聲波破碎細胞后，將上清與沉淀分別行SDS-PAGE電泳鑒定表達產物。

2．4 重組蛋白的純化與鑒定：取陽性克隆菌液4ml接種到200ml的含AMP⁺的LB培養液中，用同樣的方法在IPTG誘導4h后，12000g離心收集菌體。取20ml的lmmol/LPBS重懸菌體，在冰上超聲5s，間歇5s共進行10min，然后離心收集上清并將上清過Glutathione Sepharose 4B親和層析柱純化，按Amersham Biosciences公司的操作手冊進行，分別用2.5、5、10mmol/L的GSH進行洗脫，將洗脫液行SDS—-PAGE鑒定GST-p12融合蛋白的洗脫情況。

3 結果

3．1 RT-PCR擴增DOC－1基因的蛋白質編碼序列：RT—PCR產物經1.2％的瓊脂糖凝膠電泳后，可見在人胚胎的腦組織中擴增出大小約為348bp左右的單一片斷，與目的蛋白編碼的基因(523—870位)大小一致，測序結果與人的DOC-1基因中CDS序列(GenBank NM-004642)一致。

3．2 重組表達載體的構建與鑒定：從轉化了重組質粒的DH5α菌株中提取質粒，用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ進行雙酶切鑒定，可見電泳中有一約348bp左右的目的基因片斷和一大分子量的載體片斷，測序結果也顯示與人的DOC-1基因中CDS序列(GenBank NM-004642)一致。

3．3 重組蛋白的原核表達鑒定：SDS—PAGE分析結果顯示，經IPTG誘導的含重組質粒的E.coliBL21在相對分子量38000左右的位置上出現一條新的條帶。

3．4 重組蛋白的純化：超聲破碎菌體并離心后，分別取裂解液上清與沉淀進行SDS—PAGE，顯示目的蛋白主要在上清中表達。將上清過GlutathioneSepharose 4B親和層析柱純化并用lOmmol/L的GSH洗脫下大部分目的蛋白。

4 討論

腫瘤的基本特征是細胞的失控性生長，包括細胞的程序性死亡(或凋亡)的減少、增殖的增加以及細胞的去分化等多種細胞生命活動。抑癌基因在控制細胞生長、增殖及分化過程中起著重要的負調控作用，并能抑制腫瘤生長。Sherr的研究提示表達外源性p12^DOC-1蛋白的惡性角化細胞的增殖周期明顯延長可能與細胞周期調控蛋白和激酶相關。Shintan等通過體外實驗篩選了CDK家族的7個成員，證明了p12^DOC-1蛋白與CDK2的緊密聯系，認為p12^DOC-1蛋白為CDK2的分子伴侶。Hu等近期利用建立的p12^DOC-1蛋白表達缺陷HaCaT細胞系研究發現：該細胞系中CDK2相關激酶活性增加；pRb磷酸化；部分逆轉了TGF—β—1對CDK2相關激酶活性、pRb磷酸化、細胞增殖的抑制。研究還發現TGF—α—1可以誘導p12^DOC-1蛋白的表達，也可以說p12^DOC-1蛋白通過CDK2介導了TGF-β—1的生長抑制活性。

DOC-1基因在人體組織心、腦、肝、胰、肺、骨骼肌、胎盤、腎中均可以檢測到，因此我們選擇流產胎兒的腦組織提取總RNA，然后根據GenBank(NM-004642)提供DOC-1全長基因序列先設計不帶酶切位點的引物，以保證擴增完整序列的成功率再測序確認，并將基因克隆入T載體上，再在前次設計的引物基礎之上，設計出帶酶切位點及保護堿基的引物，直接從T載體上擴增目的基因。實驗證實均一次擴增成功，設計兩種引物并不繁瑣、費事，反而提高了實驗的成功率，節省了時間。表達載體選用pGEX-4T-l，該載體在E.coli中表達重組蛋白是很常用的，因表達的融合蛋白連有GST標簽，可以與谷胱甘肽瓊脂糖進行特異性的結合，然后應用還原型谷胱甘肽進行洗脫純化。雖然上清中的可溶性蛋白含有少量的GST蛋白，但人體中并沒有編碼GST蛋白的基因，同時經過不同濃度的還原型谷胱甘肽可以洗脫掉大部分的GST蛋白，從而得到較高純度的含目的基因的重組蛋白。在GST的C端有凝血酶特異識別的切割位點，其下游有多克隆位點，可插入外源基因，兩個基因表達產物即為融合蛋白，也可通過凝血酶進行切割分離將GST蛋白部分切除得到單一的p12^DOC-1目的蛋白。而且融合表達載體可以提高相對分子量，增加蛋白質的穩定性；也可提高p12^DOC-1蛋白對動物肌體的免疫原性，為下一步制作抗體打下基礎。

本實驗通過酶切鑒定和序列測定，證明了基因的合成和表達載體的構建完全正確。通過IPTG誘導表達，以Glutathione sepharose 4B親和層析柱純化，經SDs—PAGE分析表明GsT—p12重組蛋白的表達與純化是成功。