超薄表皮片移植細胞異位的初步研究

[摘要]目的：了解超薄表皮片移植中干細胞的分化和分布的狀況，初步探討創面修復過程中細胞異位現象的存在。方法：超薄表皮片用中性蛋白酶分離自人環切術的包皮，反復沖洗使表皮干細胞脫落。分別用HE染色、免疫組化和DAPI標記后移植于8只裸鼠。第4天和第7天活殺取材，常規HE和石蠟與冰凍切片染色。用光學顯微鏡和熒光顯微鏡觀察皮片的形態學改變，用免疫組化的方法評估表達角蛋白19和14細胞的分化和分布。結果：染色顯示未移植皮片有正常的層次結構，但移植的皮片細胞層次有松弛紊亂的跡象，免疫組化顯示CK14和CK19陽性細胞有異位現象；冰凍切片熒光顯微鏡下在基底層之外亦見有孤立成團同時雙染的CK19陽性細胞。這些現象在移植后的第4天最為顯著。結論：表皮細胞在超薄表皮片移植中顯示出CK14和CK19陽性細胞有異位現象，這種特異性細胞的異位可能參與了創面修復以及之后表皮重塑。

[關鍵詞]表皮片；干細胞；移植；裸鼠；創面修復

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0313－04

皮片移植是燒傷治療中最常用的手術方式，由于刃厚皮片較薄，生長所需條件低，在感染創面上生長容易及供皮區不受限等特點，因此在治療大面積燒傷及其他皮膚疾病起著舉足輕重的作用。刃厚皮片移植到有血運的創面后，早期靠創面滲出的血清維持營養，5～24h后，皮片與受區創面間有中性粒細胞浸潤，同時受區創面向皮片生長血管芽，48h到達真皮與表皮的結合處，初步形成新生的毛細血管，因此皮片易于在創面成活，7天左右可建立良好的血運。值得注意的是，長期以來人們關注創基條件對皮片成活的影響，輕視了皮片本身細胞的增殖分化能力對創面愈合的作用。刃厚皮片移植后細胞的增殖分化是如何進行的?鮮見有文獻報道。故筆者以分離的超薄的表皮片為研究對象，建立了表皮片移植后的細胞示蹤模型，觀察在基底層細胞相對不足的情況下表皮細胞增殖分布特點，為以后進一步研究表皮細胞的增殖分化奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 包皮來自無泌尿系感染等疾病7～25歲行包皮環切術的患者。經知情同意由解放軍空軍總醫院泌尿外科提供。實驗動物為裸鼠，體重20g左右，許可證號：SCXK京2004－0001，購自中國醫學科學院宣武動物所；麻醉劑速眠新Ⅱ(軍事醫學科學院獸醫研究所)。

1．1．2 消化液：中性蛋白酶(dispose)，以D～hanks分別配制2mg/ml中性蛋白酶溶液，過濾滅菌后－20℃保存備用。

1．1．3 DAPI(Sigma)染液：稱取1mg DAPI，用DMEM/F－12(GiBCO)培養液溶解定容至20ml，0.22μm微孔慮膜過濾除菌，4℃下避光保存。工作濃度為50μg/ml。

1．1．4 抗體：鼠抗人角蛋白10、14和19IgG單抗(福州邁新)，山羊抗鼠IgG2(北京中山)，以熒光素羅丹明標記的山羊抗鼠IgG2(北京中山)，兩步法細胞免疫化學。

1．2 方法

1．2．1 表皮片的處理：將包皮剪切成約2.0cm×2.0cm左右的皮片，中性蛋白酶消化4℃過夜；吸棄dispase，D－Hanks液清洗后，仔細分離表皮層，設立未處理組，其余真皮面向上，用D－Hanks反復吹打漂洗進行預處理。

1．2．2 皮片移植和取材：將處理的表皮片移植前3h，加入DAPI染液，避光孵育3h，用Hank’s液沖洗7次以上去除未結合DAPI。根據無菌操作，裸鼠麻醉后，每只裸鼠背部人為設計0.5cm²大小的1～4個創面，創基噴rhEGF和bFGF，將處理過的超薄表皮片移植于8只裸鼠背部，纖維蛋白膠封閉創面，內襯少許紗布，創可貼包扎。

1．2．3 取材及標本制作：單籠密閉包喂養4～8天，隨機于第四天和第七天引頸活殺取材，分別制作石蠟(厚度3～5μm)和冰凍切片(厚度4～7μm)。常規滴加一抗及熒光標記的第二抗體，甘油封片。光鏡及熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2．1 皮片的染色結果：分離的表皮片在HE染色及免疫組織化學染色下，表皮片細胞排列規律整齊，細胞層次較為明顯。CK10用陽性細胞多分布于表皮淺層，CK14分布在基底層及棘細胞層甚至顆粒層。未行預處理的表皮片CK19染色可見陽性細胞單層排列于基底層，呈波浪狀。而經預處理的表皮片僅見少量CK19陽性細胞排列于基底層，基底層細胞排列不連續。

2．2 裸鼠及移植皮片的成活情況：裸鼠共8只，其中有3只試驗結束前死亡，其原因可能是麻醉及包扎過重所致。皮片移植后，分別于第四天和第七天取材。打開包扎裸鼠創面較移植前縮小，至第七天縮小更明顯。排除脫落，共13個創面，兩個創面皮片未成活，系包扎不確切所致，11個創面皮片成活良好，顏色尚可。HE染色顯示表皮細胞極性分布存在，皮片松弛，大體細胞層次增多，皮片變厚，創基有炎性細胞浸潤。

2．3 石蠟切片免疫組織化學染色結果：鏡下CK14陽性細胞較未移植前增多，排列紊亂，在皮片內分散分布，個別部位可見分布擁擠現象。CK19陽性細胞脫離基底層，可見分散孤立的分布于皮片內。移植的皮片細胞層次有松弛紊亂的跡象。上述現象在移植后的第四天最為顯著。但系列切片未觀察到“干細胞島”現象。

2．4 冰凍切片：DAPI熒光及免疫組化染色結果：熒光顯微鏡下，在藍色波長下觀察到移植表皮片區域有藍色密集顆粒，系DAPI標記細胞的表皮細胞核，其與鼠源性組織的自發熒光區分度較為明顯。紅光激發波長為543nm，在560nm波長觀察可見皮片內有少量的羅丹明標記山羊抗鼠IgG的明顯著色，排列不規律。鼠源性組織有著色區，可能是冰凍切片較厚而造成的假陽性。

3 討論

表皮分為五層，從里向外依次是：基底層、棘細胞層、顆粒層、透明層及角質層。具有增殖能力的細胞包括表皮干細胞和短暫擴充細胞，它們主要定位于表皮基底層和棘細胞層，通常認為CK19和CK14分別是他們分化的階段性標記物。中性蛋白酶能溫和地分離去除真皮層，獲得的超薄表皮片內含有基底層細胞在內的各層表皮細胞。理論上講，位于基底層的表皮干細胞由于失去的基底膜的貼附，在機械沖擊下更容易分離下來。結果表明在機械沖擊下基底層細胞CK19陽性細胞的連續性斷裂，說明表皮干細胞減少。表皮于細胞是皮膚發生、修復、重塑的關鍵性源泉。對于修復皮膚缺損的皮膚移植物，表皮的永久再生需要有干細胞移植其中。那么將這些表皮干細胞相對不足的表皮片移植至創面上又會怎樣呢?HE染色觀察到皮片移植后，皮片松弛變厚，表皮細胞極性分布存在，總體細胞層次增多，創基有炎性細胞浸潤。在創面愈合過程中，該皮片一方面通過自身的細胞增殖參與創面愈合，另一方面在創口逐漸收縮的過程中，皮片變厚，從而在質和量上加固創面。免疫組織化學顯示，較移植前，CK14陽性細胞增多，皮片內分散存在，個別部位可見排列擁擠。而CK19陽性細胞脫離基底層，可見分散孤立的分布于皮片內。在熒光顯微鏡下可見到少量DAPI和CK19同時著色的陽性細胞，分布不規律。這種特異性的角質形成細胞的極性分布紊亂現象在移植后的第四天最為顯著。那么如何解釋在表皮片中出現的CK14及CK19陽性細胞的異位分布現象?由于在皮片移植之前對表皮片進行示蹤，熒光顯微鏡下在皮片內未見到DAPI陰性而角蛋白陽性著色的細胞，基本上排除了異源性細胞浸入皮片內的可能。我們推斷，在上皮－間質界面形成由復雜的細胞信號組成的“微環境”的作用下，可能有以下原因：一是ESC和TAC產生了“跳躍”，即伴隨著機體創傷修復信號的啟動，ESC和TAC快速地向表皮上層遷移，能動的參與創面的修復；二是由于機體創傷修復的緊迫性，雖然ESC和脫離表皮基底層進入了分化狀態而形成了短暫TAC，TAC進而分化為PMD細胞，但這些TAC和PMD細胞的狀態尚屬幼年期，仍表達更為原始細胞的某些特征；三是是否存在由成熟的表皮細胞逆分化為ESC樣細胞或TAC樣細胞。成熟細胞可通過去分化、轉分化和逆分化方式向腫瘤細胞、其他(胚層的)成熟細胞和干細胞轉變。這些細胞可能在喪失表達原細胞蛋白分子或結構特征的同時，合成和裝配了新生細胞的蛋白，從而完成成體細胞的異常分化(逆分化和/或轉分化)過程。但其中具體的分子生物學機制，值得進一步研究。如何解釋特異性的角質形成細胞的異位現象在移植后的第四天最為顯著的現象?皮片移植第四天是血運正在建立但仍未穩定時期，血液循環呈擺動或呆滯的緩慢移動。此時的皮片逐漸適應新的環境，表皮細胞處于缺血及缺氧狀態，加上人為添加的rhEGF及bFGF在局部產生的作用，由此復雜的共同的信號轉導所產生了一系列的分子生物學效應，可能導致了上述三種可能機制的發生。事實上，體外的實驗研究中第四天也是一個關鍵點。McGann cJ等利用早期蠑螈的肢體再生提取物來誘導C2C12小鼠的肌管，觀察到最大量的肌管進入細胞周期并形成增殖性的單個核細胞發生于第三天，第四天呈持續狀態。Shuibing Chen等用一種名為“逆轉素”的小分子物質誘導C2C12肌管。加入該物質后4天后，肌管形成完全被抑制，細胞不斷地形成單核細胞群，肌漿蛋白特異標志如MyoD和myosin培養開始消失，此后細胞在成骨或脂肪誘導條件下表現為相應再分化細胞特異性標記物。這種體內和體外實驗在時間上的巧合，是否提示四天之中細胞獲得了可塑性，在發育上發生了根本性的逆轉；這種細胞異常分化的節點是一種必然還是偶然值得探討。本實驗觀察到特異性的角質形成細胞的異位分布及皮片增厚的現象，我們考慮不能排除表皮細胞在超薄表皮片移植中顯示出逆分化和再分化。這種特異性細胞的異位可能參與了創面修復以及之后表皮重塑。