血管緊張素Ⅱ對增生性瘢痕成纖維細胞生長增殖的影響

目的：探討血管緊張素Ⅱ及其Ⅰ型受體(AT₁)拮抗劑洛沙坦(losartan)對增生性瘢痕成纖維細胞生長增殖的影響。方法：體外分離培養增生性瘢痕戍纖維細胞，在不同濃度的血管緊張素Ⅱ、losartan、PD123319作用下，觀察成纖維細胞的生長情況，并繪制生長曲線，采用MTT法和3H－TDR摻入釋放法分別檢測成纖維細胞增殖和DNA含量的情況。結果：血管緊張素Ⅱ在濃度為10^-8Smol/L～10^-5mol/L時，成纖維細胞的細胞數量明顯增多，DNA含量增加(P＜0.05)；losartan能幾乎完全抑制AngⅡ的這種作用，PD123319對此作用幾乎沒有影響。結論：AngⅡ可促增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，該作用主要通過AngⅡ的Ⅰ型受體介導完成，AT₁的拮抗劑有望在增生性瘢痕防治中發揮重要作用。

[關鍵詞]血管緊張素Ⅱ；洛沙坦；細胞增殖；增生性瘢痕；成纖維細胞

[中圖分類號]Q343.6 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0298－04

增生性瘢痕是以成纖維細胞過度增殖和膠原蛋白無序沉積為主要特征的結締組織疾病。其發病機制至今尚未徹底闡明。血管緊張素Ⅱ(an－giotensin Ⅱ，AngⅡ)作為腎素一血管緊張素系統中重要的因子，通過內分泌、旁分泌和自分泌等方式發揮其多種生物功能。其經典作用是引起血管收縮和調節水鹽平衡。目前越來越多的研究結果認為Ang Ⅱ作為一種生長因子，是一種強烈的有絲分裂原，在促進心肌間質、腎臟間質、肺間質以及血管壁纖維化的過程中發揮重要作用。本研究的目的在于觀察Ang Ⅱ及其Ⅰ型受體拮抗劑洛沙坦(losartan)對來源于人類增生性瘢痕成纖維細胞的生長和增殖的影響，為探索增生性瘢痕的發生機制及防治方法提供資料。

1 材料和方法

1．1 主要試劑：Ang Ⅱ、Losartan、PD123319(美國Sigma)；DMEM培養基(美國Hyclone)；胎牛血清(美國Hyclone)；3H－TDR(北京原子能研究所)；四甲基偶氮唑藍(MTT，Serva分裝)；醫用凈化工作臺(蘇州凈化設備公司YJ－875型)；CO²培養箱(美國SHEL－LAB1815TC型)。

1．2 取材標準：①增生性瘢痕，瘢痕色澤紅，質硬，高出皮膚表面，均為燒傷創面愈合已超過3個月，但瘢痕仍持續增生，瘢痕局部無感染和潰瘍，均未曾使用抗瘢痕藥物、彈力加壓、放療等方法治療；②病人無高血壓、肝硬化、肺纖維化、慢性腎炎、心肌梗塞等疾病；③病人無全身感染、腫瘤；④無結締組織疾病或可能影響結締組織代謝的疾病，未全身應用皮質類固醇等藥物治療；⑤瘢痕局部癥狀典型。

1．3 實驗分組：實驗分為四組：①對照組：20％新生小牛血清的DMEM培養液：②Ang Ⅱ組：培養液中加入Ang Ⅱ，濃度范圍10％^-9mol/L～10^-5mol/L；③Ang Ⅱ+losartan組：培養液中先加入lO^-9mol/L～10^-5mol/L的losartan預處理30min，再加入同濃度AngⅡ；④AngⅡ+PD123319組：培養液中先加入10^-9mol/L～10^-5mol/L的PD123319預處理30min，再加入同濃度AngⅡ。

1．4 成纖維細胞分離、培養：采用組織塊法進行原代培養，將手術中切下的符合條件的增生性瘢痕在無菌條件下切除其表皮，在少量胎牛血清中將標本切成1mm³左右的組織塊置于培養瓶中，在95％空氣、5％CO₂、37℃、飽和濕度條件下培養6～8h，使組織塊牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養基適量，繼續培養，3～4天換液1次，2～3周后，原代細胞生長成單層，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例傳代培養，此后每2～3天換液1次，每4～5天分種傳代1次，實驗用第3～5代細胞。

1．5 繪制成纖維細胞的生長曲線：取成纖維細胞以5×10⁴個/ml的密度接種于24孔細胞培養板，每孔含有0.5ml的培養液，待其鋪滿培養板80％時，換成含0.5％小牛血清的DMEM培養液，再分別加入不同濃度的Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan，Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設三個復孔，并設立只加入培養基的對照組。培養24h后用0.25％的胰蛋白酶消化細胞，分別收集各孔細胞，用PBS洗滌后計數。

1．6 Ang Ⅱ和losartan對成纖維細胞增殖的影響：用MTT法測定成纖維細胞的增殖情況，取對數生長期的細胞，細胞以5×10⁴個/孔的密度接種于96孔細胞培養板。每孔含150μl的培養液，待細胞貼壁后，換成含10％小牛血清的DMEM培養液，再分別加入不同濃度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設三個復孔，并設立只加入DMEM培養基的對照組。細胞繼續孵育24h后，在已培養細胞的96孔板每孔中加入0.5％MTT 10μl，置于37℃4h后，棄上清，加入100tμl DMSO(二甲基亞砜)震蕩15min后，使形成的甲月贊(formazan)充分溶解。然后在酶標儀上測測定波長570nm處的吸光值。

1．7 3H～TDR摻入釋放法檢測成纖維細胞中DNA的含量：將細胞以5×10⁴個/孔的密度接種于96孔細胞培養板。每孔含150μl的培養液，待細胞貼壁后，換成含無血清的培養液，再分別加入不同濃度Ang Ⅱ、Ang Ⅱ+losartan、Ang Ⅱ+PD123319，每一濃度設三個復孔，并設立只加入DMEM培養基的對照組。細胞繼續孵育24h后，培養結束后棄去培養基，加入胰蛋白酶消化約2mim棄胰蛋白酶加入D—Hank’s液洗滌細胞數次后，收集細胞于玻璃纖維濾紙上；再經10％三氯醋酸和無水乙醇沉淀、固定后，置于70℃烘箱內烘干；將濾膜放入有閃爍液的液閃杯中測量樣本的放射脈沖數(以dpm值表示)。

1．8 統計學處理：每組實驗重復4次，以SPSS 10.0統計學軟件分析。數據以x±s表示，進行t檢驗、相關分析及多個實驗組與同一對照組的比較的方差分析，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2．1 成纖維細胞的生長情況：當Ang Ⅱ的濃度為10^-8～10^-5mol/L時，成纖維細胞增殖明顯，且與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而AngⅡ+losar－tan組中，成纖維細胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對照組相比也無顯著差異。而Ang Ⅱ+PD123319組與AngⅡ組結果相似，無顯著差異。

2．2 MTT法測成纖維細胞的增殖：MTT比色法A570nm吸光度值顯示：當Ang Ⅱ的濃度為10^-8～10^-5mol/L時，成纖維細胞增殖明顯，且與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。而Ang Ⅱ+losartan組中，成纖維細胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對照組相比也無顯著差異。Ang Ⅱ+PD123319組與Ang Ⅱ組結果相似，無顯著差異。見表1。

H3－TDR摻入釋放法檢測成纖維細胞中DNA的含量變化：以H3－TDR摻入dpm值代表細胞內DNA含量。結果表明，AngⅡ在10^-8～10^-5mol/L濃度范圍內，成纖維細胞的DNA含量明顯增多，與對照組有顯著差異(P＜0.05)；而Ang Ⅱ+losartan組中，成纖維細胞的增殖不受Ang Ⅱ的影響，與對照組相比也無顯著差異。Ang Ⅱ+PD123319組與Ang Ⅱ組結果相似，與AngⅡ組無顯著差異。見表2。

3 討論

腎素一血管緊張素系統(RAS)是機體調節血管張力和水鈉代謝的內分泌系統的組成部分，隨血液循環發揮作用。血管緊張素Ⅱ是RAS系統的主要活性成分。目前，以AngⅡ為主要因子的RAS在一些組織器官的纖維化過程中的重要作用正逐漸引起越來越多學者的關注。在纖維化過程中，局部組織的RAS激活，包括AngⅡ在內的一些因子表達水平升高，提示局部RAS可能參與了組織器官纖維化和/或結構重構過程。這樣的器官包括肝臟、腎臟、心臟、肺和皮膚。ACE抑制劑、Ang Ⅱ受體拮抗劑和阻斷劑等可通過不同方式延緩和/或抑制器官纖維化的發生，進一步說明Ang Ⅱ有促器官纖維化的作用。Ang Ⅱ受體主要分為AT₁、AT₂兩種亞型，AT₁受體是一種膜受體，它具有激素受體的所有特征。它介導血管緊張素Ⅱ受體的大部分生理功能。Sun等檢測到AT₁在心肌纖維母細胞上的表達，Bril－la等通過3H－TDR摻入釋放法和膠原酶活性分析法發現，Ang Ⅱ在10^-7mol/L時心肌纖維母細胞大量增殖，膠原合成增加。有學者在腎臟間質、肺組織、肝組織中也檢測到了AT₁受體，研究發現AngⅡ能促進這些器官組織的纖維化。

增生性瘢痕是皮膚創面愈合后瘢痕持續增生的一種病理表現，其機制目前還不清楚。近年來的研究表明，AngⅡ能促進皮膚成纖維細胞的增殖和細胞外基質的沉積，提示AngⅡ在人類瘢痕形成可能具有獨特的作用。劉宏偉等研究發現，在瘢痕形成過程中血管緊張素轉化酶和血管緊張素Ⅱ表達增加，提示在瘢痕形成過程中皮膚局部RAS系統的激活，在瘢痕的形成和調控中發揮作用。

在本實驗中，來源于人增生性瘢痕的成纖維細胞受到濃度高于10^-8mol/L的Ang Ⅱ刺激時增殖明顯，且與AngⅡ的濃度呈正相關關系，濃度越高增殖越明顯。AngⅡ的Ⅰ型受體AT₁的拮抗劑losartan能夠完全抑制該作用，而Ang Ⅱ的Ⅱ型受體拮抗劑PD123319對此作用沒有影響。

通過以上結果推測，在增生性瘢痕發生過程中起關鍵作用的成纖維細胞，在AngⅡ的作用下，通過結合該細胞上的受體AT₁，大量激活并增殖，而AT₁的拮抗劑losartan通過阻斷AT₁，減少成纖維細胞的生長增殖。腎素一血管緊張素系統可能參與了瘢痕的形成，對皮膚局部的RAS系統的研究可能在探索瘢痕增生的機制和皮膚創面及瘢痕治療方面開辟一個新的途徑。