納米微囊－ＶＥＧＦ復合體轉染對慢性創面愈合影響的研究

[摘要]目的：研究納米微囊－VEGF復合體轉染對慢性創面愈合的影響。方法：以VEGF為目的基因，構建真核表達載體pcDNA3.1/myc－hisA－VEGF165，納米微囊包裹后作用于兔耳慢性創面，于術后14天通過創面觀察以及組織學染色、顯微測量，觀察其對創面的影響。結果：轉基因組創面肉芽生長及上皮爬行速度明顯快于慢性創面組；HE染色轉基因組肉芽組織中大量的成纖維細胞聚集，微血管數量增多；新生上皮生長NEG在非缺血創面組最高，慢性創面組最低，其中前者較后者增加249％，而轉基因組較慢性創面組增加了165％；肉芽組織厚度PH轉基因組較慢性創面組增加了70％，而非缺血創面組較慢性創面組增加了46％；肉芽組織體積NGTV在轉基因組及非缺血創面組與慢性創面組比較，分別增加了317％、302％。結論：非病毒載體納米微囊－VEGF復合體能明顯促進慢性創面愈合。

[關鍵詞]血管內皮生長因子；慢性創面；愈合；納米微囊；轉染

[中圖分類號]R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0291－04

慢性創面的治療一直是臨床工作的難題之一。隨著社會人口老齡化，臨床病例日漸增多，促使我們不斷探索新的治療途徑。近年來，外源性生長因子的應用成為研究熱點，并取得一定成績。而慢性創面愈合的一個關鍵環節是新生血管的形成，其中VEGF是已知作用最強的血管生成調控因素Ⅲ。因此，深入研究VEGF在慢性創面形成中的作用具有深遠的意義。目前國外文獻已有外源性重組VEGF在傳統兔耳缺血創面模型的應用報道，但VEGF在創面快速降解的特性也使其給藥途徑具有局限性。

本實驗將納米微囊非病毒截體基因轉移技術應用于兔耳慢性創面研究，這種技術具有無免疫原性、較高的轉染效率，以及長時間緩釋功能等優越性。實驗證實外源性VEGF基因局部應用可以明顯促進兔耳慢性創面的愈合，為臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1．1 納米微囊－VEGF復合體的制備：參考相關文獻資料制備帶有VEGF的真核表達載體(pcDNA3.1/myc－hisA－VEGF)，取25μl 1.70D上述載體，PBS稀釋至50μl，與10mM納米微囊50μl渦旋振蕩混勻，靜置30min。100μl為每個創面滴加量。納米微囊－空載質粒(不含VEGF基因)作為對照。

1．2 動物模型制作及分組：健康新西蘭白兔8只，48～60月齡，體重3.9～5.0kg(第四軍醫大學實驗動物中心提供)，利用我們白建的方法構建兔耳慢性難愈性創面模型。在耳腹側制成3個慢性創面的同時，另在環切部位的近端腹側皮膚制備一個φ=6mm的圓形創面，作為非缺血對照。據此將本實驗共分為三組：轉基因組(一側兔耳慢性創面滴加納米微囊－VEGF復合體，以CW+VEGF表示)、慢性創面組(另側兔耳慢性創面滴加空載質粒，以CW表示)、非缺血創面組(雙側兔耳非缺血創面滴加空載質粒，以NW表示)。創面包扎、手術環節等步驟均同原文。①CW+VEGF組：明膠海棉薄片蘸取100μl納米微囊－VEGF復合體覆于每個創面；②CW組：明膠海棉薄片蘸取100μl空載質粒覆于每個創面；③Nw組：明膠海棉薄片蘸取100μl空載質粒覆于每個創面。

1．3 取材：術后14天全部動物處死，以每一創面為中心，切取1cmx 1cm正方形組織塊(含兔耳全層)，并自創面正中對稱二等分切開。標本迅速固定于中性福爾馬林液，常規石蠟包埋、切片(厚度5μm)、HE染色。

1．4 創面觀察：觀察各組創面肉芽組織生長情況。

1．5 組織學觀測：創面橫斷面HE染色，鏡下觀察創緣新生肉芽組織增生情況，并以顯微測微標尺精確測量上皮間距EG(Epithelial Gap)、肉芽組織間距GTG(Granulation Tissue Gap)及肉芽組織最大厚度PH(Peak Height)，從而得到反映創面愈合的三個重要指標：①新生上皮生長NEG(New EpithelialGrowth)=6mm－EG；②肉芽組織體積NGTV(NewGranularion Tissue Volume)=肉芽組織面積×PH，其中肉芽組織面積=[(6－GTG)/2]2×π；③肉芽組織最大厚度PH。

1．6 統計學處理：所得數據采用SPSS10.0統計軟件對數據進行ANOVA和post－hoc檢驗，分析組間和兩兩差異，顯著性差異標準a為0.05。

2 結果

在術后3天，CW+VEGF組及NW組已見創緣有很少量肉芽形成及上皮爬行，色澤鮮紅，在7天時生長已很明顯。而CW組7天時尚未見明顯肉芽組織形成。術后14天，CW組有少量肉芽及上皮化出現，而其它兩組已有多量新生組織，顏色較3天及7天時稍淡，其中有3例創面完全愈合。

HE染色顯示，14天時CW組表皮層完整，肉芽組織中大量炎細胞浸潤，但成纖維細胞及新生血管管腔數量少；而CW+VEGF組新生表皮層較厚，表皮突明顯，肉芽組織中大量的成纖維細胞聚集，微血管數量增多，僅散在少量炎細胞浸潤。Nw組與CW+VEGF組差距不明顯。這說明在肉芽組織生長期CW組肉芽增生緩慢，而其他兩組肉芽增生活躍。

在術后14天，新生上皮生長NEG在三組之間兩兩比較均有統計學意義，P＜0.05。Nw組最高，CW組最低，其中NW組較CW組增加249％，而CW+VEGF組較CW組增加了165％。肉芽組織厚度PH在三組間兩兩比較也有顯著性差異，P＜0.05。CW+VEGF組較CW組增加了70％，而NW組較CW組增加了46％。肉芽組織體積NGTV在CW+VEGF組及NW組無明顯差異，但與CW組比較均有統計學意義，P＜0.05。它們分別增加了317％、302％。以上結果表明：與非缺血創面相比，慢性創面的肉芽組織生長及上皮化速度明顯下降；而轉基因組全面提高了慢性創面的愈合指標數據，尤其對肉芽組織增生(PH)的促進作用較上皮化作用(NEG)更強。

3 討論

近年來的大量研究表明，生長因子可以在一定程度上促進創面愈合，而血管內皮生長因子(VEGF)就是其中一類，又稱血管滲透因子(VPF)，它是牛垂體星狀細胞體外培養分離出的一種糖蛋白。根據VEGF mRNA的剪接方式不同，存在5種變異體，分別是：VEGF121、165、189、206、145，其中VEGF165是最多見的蛋白表達形式。它最主要的功能表現在兩個方面：①它在體內體外都特異性地促進血管內皮細胞的增殖并誘導血管生成，是目前最強的促血管內皮細胞有絲分裂原：⑦它還可以增強微血管通透性，導致血漿蛋白廣泛的外漏，其中包括纖維蛋白原、血漿酶原、纖維粘連蛋白等，這些蛋白直接或間接改變了細胞外基層成份，使其形成暫時性新基質，允許并支持內皮細胞和成纖維細胞的遷移，有利于創傷的修復。

對于慢性創面，由于VEGF蛋白及mRNA表達較正常創面下調而導致的血管生成下降，這被認為是慢性創面不愈合的重要原因之一。由此也為外源性VEGF在慢性創面的應用研究提供了理論依據。Claudio等通過兔耳缺血創面模型證實，外源性重組VEGF可以促進缺血創面肉芽組織增生及毛細血管的生成。當劑量為30μg/創面時，在缺血創面第十日，用藥組肉芽組織面積增加了100％～150％。而在非缺血創面第七日，肉芽組織面積增加了50％～70％。該實驗還證實了VEGF較bFGF更為有效地促進了缺血創面愈合。Zhang等在對鼠缺血皮瓣模型及缺血傷口模型的研究中發現，外源性VEGF能夠明顯促進皮瓣的血管形成及傷口的抗張力強度，提高皮瓣的成活率及加速傷口愈合。另有研究者將VEGF121 cDNA組裝成PCS－121，用脂質體包裹用于腹壁上動脈皮瓣早期斷蒂的實驗，結果顯示PCS－121組皮瓣成活面積93.9％，明顯高于對照組的28.1％、31.9％。

目前，在創傷修復領域內VEGF的給藥方式主要有蛋白注入和基因轉染兩種。蛋白注入方式因技術簡便，作用直接、見效較快，故采用較多。其方法有：皮內、皮下、筋膜下、肌肉內、動靜脈內注射、靜脈滴注等。Padubridri等將5μg重組VEGF注入10cm×10cm軸型皮瓣血管蒂，提高了皮瓣成活面積。Kryget等報道多次高濃度靜脈給藥效果最佳。但是，VEGF蛋白不穩定，易水解成為沒有活性的單體，其半衰期僅為6min，而且VEGF蛋白價格昂貴，單次較大劑量應用時可能會導致血流動力學紊亂，故蛋白注入給藥方式具有很大局限性。近年來隨著基因轉染技術的飛速發展，VEGF轉基因治療成為一種使其在局部持續發揮作用的有效方法。由于VEGF為分泌性蛋白，有信號肽序列，即使基因轉染的效率較低也可能發揮明顯的生物學效應，其一次給藥就可獲得短期內持續表達，且需要的質粒DNA量較少。Baumgartner報道在10外病變部位分別接受總量4000μg質粒的治療，結果7例血管造影證實有新生側枝血管，8處肢體遠端血流改善，其效果等同于或優于外科手術及介入治療。所以在本實驗中采用新型材料納米微囊為載體包裹VEGF質粒，通過局部給藥促進了兔耳慢性創面的愈合，而國外實驗研究發現，納米微囊載體在動物體內依然有較高的轉染效率。

在實驗中我們觀察到，慢性創面組肉芽組織生長及上皮爬行緩慢，在7天時尚未見明顯肉芽形成，14天時也僅有少量肉芽及上皮化出現，較其它兩組差別較大，這印證了該動物模型的可靠性。HE染色結果進一步證實了上述觀察。在14天時慢性創面成纖維細胞、上皮細胞增生不活躍，新生毛細血管管腔數量少，而其它兩組細胞增生相對活躍。這導致了慢性創面與非缺血創面在愈合速度上的差距，同時也說明外源性VEGF基因導入能有效提高慢性創面愈合速度。正常創面的愈合修復過程大致分三個階段：①炎性滲出期：傷后48h內以炎性細胞的浸潤為主；②肉芽組織形成期：48h以后，血管內皮細胞及成纖維細胞活躍增生，在損傷后5天，肉芽組織增生進入一個高峰期，7～14天后肉芽組織形成逐漸減少；③組織重塑期，3～4周后肉芽組織逐漸瘢痕化。對本實驗慢性創面的觀察顯示，其愈合過程中細胞及肉芽組織增生能力下降，愈合過程延遲。通過顯微測微標尺對組織切片的精確測量更準確地反映了三組創面愈合上的差距：新生上皮的生長NEG值，非缺血創面較慢性創面增加了249％，而轉基因創面增加了165％；肉芽組織厚度PH值，非缺血創面增加了46％，轉基因創面增加了70％；肉芽組織體積NGTV值，雖然非缺血創面與轉基因創面比較無統計學意義，但較慢性創面分別增加了302％、317％。值得注意的是，轉基因治療后，PH值增加明顯，顯著大于非缺血創面，說明VEGF對肉芽組織增生的誘導作用較強；而NEG值小于非缺血創面，表明轉基因雖然也促進了慢性創面的新生上皮化，但上皮遷移速度尚不及非缺血組，這也決定了其最終愈合時間要落后于非缺血創面。

關于轉基因治療尚有許多問題值得探討，如外源基因是整合入基因組還是瞬時表達、在靶器官的表達持續時間、在基因停止表達后新生血管是否能持久存在、表達后蛋白效應與內源性VEGF蛋白效應是否有區別以及局部應用是否會導致遠隔器官病理性血管增生，以及其具體的作用機理我們將進一步深入研究。