ＣＯＭＴ基因單核苷酸多態性與漢族白癜風發病的相關性

[摘要]目的：探討COMT基因單核苷酸多態性與漢族尋常型白癜風發病的相關性。方法：測定377例漢族尋常型白癜風患者及388例正常對照的兒茶酚鄰位甲基轉移酶(COMT)基因第4外顯子158密碼子堿基多態性。抗凝血抽提DNA，用PCR－SSP法和PCR產物直接測序法鑒定基因型，對結果進行統計學分析處理。結果：COMT基因第4號外顯子存在一個G＞A點突變，表現為GG純合、AA純合，GA雜合三種基因型，使其編碼的第158氨基酸由纈氨酸(Val)變成蛋氨酸(Met)。病例組A頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論：COMT－158位點的多態性與漢族尋常型白癜風具有明確相關性。

[關鍵詞]白癜風；多態性；PCR～SSP；COMT基因

[中圖分類號]R758.41 [文獻標識碼]A [文章編號]1008－6455(2007)03－0365－03

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病，由于各種原因導致黑素細胞數目減少或功能喪失，表現為皮膚局部白斑，嚴重影響患者生活質量。目前白癜風的發病機制有多種學說，包括自身免疫學說、細胞毒學說、神經學說等，其中由于代謝異常導致局部黑素細胞毒性損傷的學說日漸受到重視。兒茶酚鄰位甲基轉移酶(COMT)催化兒茶酚胺第3位羥基甲基化，是降解兒茶酚胺的主要代謝酶。文獻表明COMT基因第4號外顯子存在一個G＞A點突變使158密碼子從纈氨酸(Val)到蛋氨酸(Met)錯義突變，COMT酶活性改變，引起黑素細胞微環境毒性兒茶酚胺過量表達，從而導致黑素細胞結構和功能破壞。對中國漢族人而言，目前尚未見該基因位點多態性和白癜風的相關報道。本研究中，我們對COMT－158 G＞T單核苷酸基因多態性與白癜風發病的關系進行了深入研究。

1 材料和方法

1．1 一般資料：377例白癜風患者均來自西京醫院皮膚科門診，388名健康成年漢族人來自門診健康查體者。均無遺傳病家族史，無腫瘤、風濕病及神經系統疾病等。治療組平均年齡(24.7±13.6)歲，對照組平均年齡(26.4±13.3)歲(P＝0.703)。

1．2 DNA提取：患者填寫知情同意書，抽靜脈血10ml，枸櫞酸鈉抗凝，利用血液DNA提取試劑盒提取DNA，采取紫外分光光度計檢測DNA濃度(mg/m1)和純度(OD260/OD180)。

1．3 COMT基因型的檢測：引物特異性聚合酶鏈式反應(PCR－SSP)：引物設計利用Oligo Primer 5.0PCR引物設計軟件，分別針對COMT－158單核苷酸多態性位點設計相應引物(表1)。PCR總反應體系20μ1：10×緩沖液2.5L，20mmol/L MgCl₂2.5L，25mmol/L dNYP混合物0.2μl，20pmol/L上下游引物各1μl，5 U/μl Taq酶0.3μl，基因組DNA1μl，加高壓滅菌去離子水至20μl。循環條件為96℃1min，96℃變性20s，75℃退火30s，70℃延伸45s五個循環，之后96℃變性25s，65℃退火50s，72℃延伸30s 21個循環，之后96℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s五個循環，最后20℃ 2min。G等位基因PCR產物455bp，A等位基因PCR產物322bp。通過1.5％瓊酯糖水平凝膠電泳分離鑒定基因型，以DL2000 DNA ladder(Takara)作分子量標準品。

1．4 統計方法：基因型和等位基因頻率采用直接計數法，用Hardy－Weinberg檢測樣本是否符合孟德爾遺傳規律；基因型和等位基因頻率差異比較分別采用卡方檢測，計算比值比(0R)以及95％可信區間(CI)來判斷基因COMT－158 G＞A多態現象與白癜風發病的相關性，采用SAS統計分析軟件處理(version 8.2；SAS Institute，Inc，Cary，NorthCarolina)。

2 結果

2．1 等位基因與基因型：圖1所示為2種等位基因和3種基因型電泳圖。GG基因型只可見G組引物擴增PCR產物條帶，從基因型只可見A組引物擴增PCR產物條帶，GA型可見G組、A組兩組引物擴增PCR產物條帶。測序進一步驗證COMT－158堿基存在二態性，其堿基可為G或A，在人群中表現為GG純合子，AA純合子和GA雜合子3種基因型，其堿基變化改變了氨基酸編碼，由纈氨酸(Val)變為蛋氨酸(Met)。

2．2 基因多態性：3種基因型在所研究漢族正常對照群體中的分布經Hardy－weinberg定律吻合度檢測，達到遺傳平衡(P=0.227)，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一孟德爾群體，證實抽樣和分型結果可靠。

2．3 基因型及等位基因分布頻率：如表2所示，GG，GA，從三種基因型頻率在白癜風患者中分別占49.6％，42.2％和8.2％；在健康對照中分別占58.5％，37.4％和4.1％。經卡方檢驗，發現三種基因型在尋常型白癜風患者和健康對照人群之間存在顯著統計學差異(P＝0.010)，病例組A等位基因頻率高于正常對照組(P＝0.049)。

3 討論

COMT有可溶性(S－COMT)和膜結合性(MB－COMT)兩種分子形式，在人類其編碼基因是同一個，位于22號染色體的長臂11區帶(22q11)。COMT酶活性個體間差異很大，在人群中可以分為低活性、中等活性、高活性3種表型，并通過遺傳分析，發現其表型是由COMTH(高活性)和COMTL(低活性)兩個等位基因所決定的，以共顯性的方式遺傳。通過對不同組織和個體COMT活性的對照研究，發現在人類COMT基因第4外顯子存在一個G＞A點突變，使其編碼的158位氨基酸由纈氨酸(Val)變為蛋氨酸(Met)，導致COMT酶的活性改變。當其108位氨基酸為Met時，該酶的活性變為不耐熱，即使在生理條件下，其活性也大大降低。

研究發現，黑素代謝過程中，代謝產物對黑素細胞的自身破壞作用被認為與白癜風的發病有關，而COMT可以阻止在黑素合成中產生的毒性氧化氫醌。這些研究提示我們，低活性COMT酶引起毒性氧化氫醌在黑素細胞內的增加，從而導致黑素細胞的破壞，可能會導致白癜風的發生或發展。Tursen在一項50名白癜風患者和66名健康對照的研究中發現，在土耳其人群中，COMT－158(G＞A)單核苷酸基因多態性與面頸型白癜風的發病相關，而與其他臨床分型無關。而我們的研究發現，COMT－158(G＞A)單核苷酸基因多態性與尋常型白癜風發病顯著相關。本實驗研究結果與Tursen等的結果差異可能是由于人種的不同所引起，而和他們的研究相比，我們的樣本更大，也更加全面，因此在中國漢族人群中我們的結果可靠性更大。大量研究表明，單核苷酸基因多態性存在著人種的差異。

本實驗首次應用PCR－SSP方法發現在中國漢族人群中基因COMT－158(G＞A)單核苷酸多態性與尋常型白癜風的發病相關。但是該單核苷酸多態性位點和白癜風臨床分型到底有無關聯，更大樣本量及重復研究有重要的意義。而對功能學的進一步研究來探索COMT基因多態性與白癜風發病的關系，則更加能說明白癜風的發病機制。