麗椪２號椪柑無核機制研究

摘 要：為系統探明椪柑無核發生的機制，以無核椪柑新品種麗椪2號和普通有核椪柑為試材，對雌雄配子體的育性和親和性進行了觀察。結果表明，麗椪2號花粉發芽率、花粉染色活力和花粉粒數量等與有核對照存在顯著性差異，屬于低育型花粉。麗椪2號花粉母細胞在減數分裂期染色體行為發生了異常，出現較高頻率的染色體鏈及少部分的染色體環和落后染色體。授以高育性的雪柑花粉后，麗椪2號仍能形成無核果。切片觀察發現，麗椪2號胚囊母細胞在四核期已完全退化。因此，胚囊高度敗育是麗椪2號產生無核的主要原因。

關鍵詞：椪柑；麗椪2號；無核機制；花粉育性；胚囊敗育

中圖分類號：S666．2 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-421-06

我國是椪柑(Citrus reticulata Blanco)的原產地和主產國，面積和產量均占世界椪柑面積和產量的95％以上，其中有核椪柑占了很大的比例。據劉永忠等對我國9個省(市)主產區67份椏柑品質的調查表明，大部分樣品飽滿種子數還較多，只有少量樣品為商業無核(單果種子數平均少于5粒)，因此無核椪柑具有很高的價值。麗椪2號是由麗水市農科所和浙江大學園藝系經過8年研究共同選育成功的一個無核椪柑新品種，已于2006年3月通過了浙江省林木品種審定委員會的新品種審定(S－SV-CR-007-2006)，該品種無子率超過99.5％，且表現出樹勢強、生長快、結果早、豐產、優質、商品性好、耐貯藏等優良性狀。

對柑橘無核機制的研究前人也做了大量的工作，幾乎所有的無核柑橘品種都有阻止種子形成的不育現象，其原因和機制主要有雄性不育、胚囊敗育、自交不親和和胚早期死亡。其中雄性不育是產生無核柑橘最重要、最普遍的原因，已報道的無核或少核類型多數都與花粉育性下降有關；而其中一些無核性狀穩定的品種在雄性不育的同時又伴隨著程度不同的雌性敗育。迄今對椪柑只有雄性不育方面研究的報道，而未見有關于無核機制系統研究的報道。我們主要從花粉育性、胚囊育性和授粉親和性等方面進行了較為系統的研究，以期闡明麗椪2號的無核成因。

1 材料和方法

1．1 材料

于2005年和2006年取材2次。試材取自麗水市農科所柑橘試驗園，選材系7年生麗椪2號無核椪柑和普通有核椪柑(CK)，園區管理水平一致，樹勢健壯。研究工作在浙江大學農業與生物技術學院果樹生物技術實驗室進行。

1．2 花粉育性相關指標測定

選晴天無風的上午，于始花期采集花粉成熟的花蕾，在實驗室內用鑷子剝取花藥，在通風陰涼處自然干燥，收集花粉放入干燥器4℃低溫保存。

用體積分數70％乙醇消毒過的潔凈發絲蘸取花粉，均勻涂抹，分別接種在蔗糖質量分數為10％、15％、20％、25％并添加瓊脂質量分數1％、硼酸質量分數0.01％的固體培養基上，置于(25±1)℃的恒溫箱中，分別于12、24、48 h測定發芽率，每處理觀測10個視野，取其平均值。3次重復。

花粉量的測定采用朱更瑞等的方法，并做改良。具體步驟如下：于始花期采集即將成熟的花蕾，在實驗室內及時剝取飽滿正常未開裂的花藥50枚裝入刻度試管中，置于37 ℃溫箱中，使花藥完全爆裂．散出花粉。隨后用1 mL?昆合酶液(質量分數2.5％纖維素酶+質量分數1％果膠酶)室溫處理花藥12 h，再分別加入9 mL蒸餾水和2～3滴吐溫，充分振蕩搖勻。然后用移液槍吸取2 μL溶液滴于載玻片上，在顯微鏡下觀察，統計花粉數，重復3次。花粉量(粒／花藥)=(每載玻片上平均花粉粒總數x500×10)÷50。

花粉畸形率和花粉染色活力測定分別采用涂布制片法和I-KI法，計算各自平均值。

1．3 花粉形態掃描電鏡觀察

將2個品種新鮮花粉分別均勻散布在粘有導電雙面膠的樣品臺上，噴金鍍膜，在環境掃描電鏡(Philips XL30-ESEM)下放大500～4000倍，觀察拍照。

1．4 花粉母細胞減數分裂觀察

選取近球形、微露白，花藥呈淺黃色，直徑約3.0 mm的花蕾，卡諾同定液固定。用直接壓片法觀察染色體，改良卡寶品紅染色，鏡檢、顯微照相。

1．5 雜交試驗

授粉于2005年4月25日進行，組合為麗椪2號×雪柑：麗椪2號×麗椪2號。在授粉樹的樹冠外圍、向陽通風和營養條件好、生長健壯的結果枝上選取未開放花朵，人工授粉，套袋掛牌。分別于5月12日和7月25日統計坐果率。果實成熟期統計所有雜交果的種子數。重復3次。

1．6 雌配子體育性觀察

從4月19日始花期開始，選取2～3株健壯樹，每天下午13～14時取子房樣品1次，共15次。以后每隔15 d取樣1次，一直到7月30日為止。將采集的樣品放入FAA固定液中固定后，儲存于4℃冰箱。

石蠟切片步驟：50％乙醇沖洗材料3次，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，透蠟，包埋，切片厚度6～8 μm，番紅一同綠對染，中性樹膠封片，觀察拍照。

2 結果與分析

2．1 花外觀形態

觀察發現，麗椪2號的花與對照的花在形態上有明顯差異(圖版-A)。麗椪2號花外形略小，花瓣張開彎曲，柱頭明顯高于花藥約0.4 cm，與有核對照比柱頭略小呈長圓形，雄蕊緊貼花柱，花藥顏色略暗，細長不飽滿：有核對照整花堅挺，花瓣直立，柱頭大而扁圓，飽滿，花藥顏色鮮艷金黃，外形略大，柱頭和花藥基本處于一個平面，易于授粉。從形態上來說，麗椪2號的花極不利于傳粉受精。

2．2 花粉發芽率

蔗糖質量分數是影響花粉發芽率的重要因素之一(表1)，同種花粉在不同種類的培養基上發芽率有所不同，在蔗糖質量分數為20％的條件下2品種花粉的萌發率最高。在培養48 h后，麗椏2號花粉的發芽率明顯低于對照品種(P＜0.05)，且2年測定結果一致：在4種不同蔗糖濃度的培養基上，這種趨勢都比較明顯。

通過顯微鏡觀察發現麗椪2號在花粉萌發過程中部分花粉管發生了異常，少量的略短而粗壯，大部分細長彎曲，還有部分甚至呈螺旋狀卷曲，這種畸形花粉管不能正常的受精。

2．3 花粉量、花粉畸形率和花粉染色活力

由表2可以看出，與有核對照相比，每個麗椪2號花藥的花粉粒數量少了近1半，差異達到了顯著水平(P＜0.05)。通過肉眼觀察我們發現有核花藥飽滿充實、色澤金黃，手捻后呈黃色；而無核花藥外形干癟、淡黃偏白，手捻后呈微黃色，散粉量很少。麗椪2號的花粉染色活力顯著低于有核對照。雖然通過光學顯微鏡觀察麗椪2號與有核對照的花粉畸形率差異不顯著(表2)，但掃描電鏡結果表明麗椪2號95％以上花粉為畸形(圖版-E)。有核花粉粒為長球形或近長球形，飽滿，外壁網眼大，有4～5條萌發溝，萌發溝淺，溝界極區大(圖版-B.D)；麗椪2號花粉表現為畸形的凹癟狀或棗核狀，多處條狀凹陷，外壁網眼小，呈陷點狀，萌發溝有4～5條，但為窄帶狀，溝腹較深，溝界極區小，萌發孔內陷(圖版-C.E)。顯而易見，花粉畸形率應與花粉的育性呈負相關。

2．4 授粉試驗結果

從表3可以看出，無論是自花授粉還是授以高育性的雪柑花粉，在授粉后17 d和96 d的坐果率差異都不顯著，說明麗椪2號的無核性狀不是由自交不親和造成的；對于麗椪2號來說，無論是授以無核的麗椪2號花粉還是授以有核的雪柑花粉最終得到65個果實中只得到1粒種子，幾乎全為無核果，證明麗椪2號的無核性狀是由雌性器官敗育引起的。但是通過授粉能夠促進子房的發育，使其坐果。

2．5 花粉母細胞減數分裂觀察

觀察發現，麗椪2號染色體數目并沒有加倍，仍為二倍體(2n=2x=18)(圖版-I)；花粉母細胞分裂異常，主要表現為分裂前期I出現染色體鏈(圖版F)和染色體環(圖版-G)，后期I在有些母細胞中還出現不均等分裂和落后染色體現象(圖版-I)。其中染色體鏈比例高達37％，組成鏈的染色體個數從3～9個不等，染色體環的比例約為8％，最典型的是細胞中出現了染色體鏈上套有染色體環(圖版-H)，這些成鏈的染色體在后續的分裂過程中不能與同源染色體配對，形成敗育或低育小孢子。電鏡(圖版-E)中觀察到的畸形花粉可能是由這種染色體畸變引起的。在后期I中染色體向兩極移動時還會出現分裂不均等現象，甚至出現移向一極的數目比另一極多1倍以上的情況(圖版-I)。統計發現不均等分裂和落后染色體所占的比例都為2％左右。這些染色體異常都可能會導致麗椪2號的花粉畸形，進而造成花粉低育。

2．6 胚囊發育情況

觀察發現，供試品種的胚囊發育到四核期時開始敗育。對有核對照來說，到受精后第7天可見胚囊內受精卵已經進行有絲分裂發育成球形胚(圖版-J)。而麗椪2號在胚囊發育過程中，在花后第2天觀察胚囊二核期(圖版-K)，花后4-5 d的胚珠中觀察到了胚囊四核期(圖版-L)，但是在其后的連續切片中未發現有八核期的胚囊，隨著發育進程，麗椪2號胚囊中空，其形狀由長形(圖版-M)逐漸變為圓形(圖版-N)，圓形空腔逐漸增大，到花后第11～12天在珠心中出現明顯的球形空腔(圖版-0)。

3 討論

王丹曾報道，錦橙的花粉在萌發后會形成正常花粉管和異常花粉管2種類型，正常花粉管在光學顯微鏡下呈透明的長管狀，管頂端略膨大；異常花粉管為不透明的螺旋狀，隨培養時間的延長不能像正常花粉管一樣伸長，只能保持剛萌發時的狀態。掃描電鏡發現正常花粉管有明顯的胼胝質壁，其中的細胞質隱約可見，而異常花粉管從萌發孔處萌發后沒有透明的壁形成，也不成管狀，長度較短，明顯地表現出畸形。實驗中發現麗椪2號花粉管在光學顯微鏡下看到呈細長彎曲狀，甚至出現嚴重的螺旋狀，這與錦橙花粉管的異常類型類似；通過對麗椪2號和有核對照的掃描電鏡觀察，發現麗椪2號的花粉幾乎完全為畸形，而有核對照花粉球形飽滿。丘杰等認為花粉管停滯生長很可能是由于胼胝質在花粉管末端不規則堆積而鈍化造成的；筆者認為花粉管的這些異常現象可能與育性基因變異而導致花粉營養缺陷有關。所以麗椪2號的花粉絕大多數為畸形，發育不良。這勢必會抑制花粉管的正常生長。這種類型的花粉在柱頭上即使萌發后也無法進入子房完成受精。

已報道的無核(少核)類型多數與其花粉育性下降有關，無論是自然芽變還是輻射誘變，雄性不育突變體都占了很大比例，如80-1甌柑、路比血橙無核系2216、黔陽無核大紅甜橙、穗龍1號無核甜橙等都是花粉敗育的無核芽變品種，胞質不育型的花粉敗育特性可以通過有性雜交遺傳給后代，陳力耕等曾用胞質雄性不育的溫州蜜柑與甜橙雜交獲得了花藥不育的晚蜜1號無核雜種。本研究中麗椪2號在花粉母細胞減數分裂前期出現較高頻率的染色體畸形，其花粉發芽率2年的測定結果分別為1.18％和0.82％，屬于低育類型。由此可見，麗椪2號的花粉低育是核不育造成的。

近些年來，各地通過實生和芽變選種選育出了許多優良的無核或少核柑橘品種，對無核成因也進行了很多研究，大部分品種的無核成因主要是花粉敗育或低育，涉及胚囊敗育等無核機制的研究尚無報道。本研究發現麗椪2號胚囊敗育的時期主要發生在四核期，胚囊在花后2 d已經開始退化，胚囊四核期后出現大量退化，沒有看到分裂為八核期的胚囊。說明麗椪2號胚囊的退化時期較早，退化程度高，前人曾觀察到華盛頓臍橙雌配子退化的高峰期也在胚囊的四核期，同時在大孢子期及胚囊的二核期和八核期也都發生類似的退化現象。可見，麗椪2號的胚囊敗育程度比華盛頓臍橙更高。因此，麗椪2號在任何情況下都無法完成正常的受精過程，這是麗椪2號完全無核的根本原因。

4 結論

胚囊高度敗育是麗椪2號無核性狀形成的主要原因。雄性器官發育不正常和花粉母細胞減數分裂異常引起的花粉低育對麗椪2號無核性狀的形成也有重要影響。