香榧莖段離體培養再生植株的研究

摘 要：對香榧莖段不定芽誘導研究的結果表明，不定芽誘導的最佳培養條件為：培養基為B₅+KT0.1 mg／L+IBA0.5mg／L+0.08％活性炭+2％葡萄糖，培養溫度為20 ℃，光強不高于400 lx，該條件下的不定芽誘導率可達55％。將不定芽培養在1／2 B₅+IBA 0.1 mg／L+0.08％活性炭+2％葡萄糖的生根培養基上，生根率最高達到40％。通過器官發生途徑國內外首次建立了香榧離體再生體系和快繁體系，并獲得了完整的再生植株，為今后開展香榧的遺傳轉化和品種改良奠定了基礎。

關鍵詞：香榧；莖段；不定芽；再生植株

中圖分類號：S664．5 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-477-06

香榧(Torreya grandis cv.Merrillii)屬紅豆杉科香榧屬，第三紀孑遺植物，是我國特有的珍稀經濟林樹種。它集果用、油用、藥用、材用和綠化觀賞為一體，經濟價值非常高。香榧種子胚乳含有營養豐富的油脂、碳水化合物、蛋白質和氨基酸，是我國著名的干果和食用油原料之一。種仁炒熟后松脆可口，營養豐富，香味獨特。種仁可入藥，有化痰、止咳、潤肺、明目、殺蟲、殺菌的功效。香榧油可預防血管硬化、冠心病。另外，香榧與紅豆杉一樣，也含具有抗癌活性的生理活性物質——紫杉醇圈。尋找和擴大紫杉醇的藥源途徑，以及通過細胞培養而研究生物堿特性方面的研究已引起科學家們的極大興趣。由于香榧的珍貴及其較高的開發利用價值，因此，近年來，學者們對香榧的研究報道逐漸增多，但研究領域主要集中在資源、栽培和良種選育等方面。隨著生物技術的發展和研究手段的進步，對香榧的探討已進入細胞水平和分子水平的深層研究。

香榧為雌雄異株，偶有兩性株，自然條件下，種子萌發緩慢，繁殖周期長，現有的繁殖方式如實生播種、嫁接、扦插法，成苗比較困難，成活率低，難以滿足生產上的要求。生產中香榧繁殖與生長速度都很慢，加之砧木種子都是混采混播，實生后代性狀發生分離或變異，影響優良單株嫁接后的純度和一致性。因此，利用香榧成年樹的莖段為外植體進行快速繁殖可以大大縮短童期，并能保持種苗的純度和一致性，這對于香榧產業的開發和增加農民收入意義十分重大。由于榧屬植物組織培養相當困難，至今國內外還沒有用香榧營養器官作外植體開展組織培養的報道。我們通過器官發生途徑建立香榧離體再生體系和快繁體系，以期為種質改良和遺傳轉化提供科學依據和技術支撐。

1 材料和方法

1．1 材料

供試材料香榧莖段采自浙江省諸暨市林業局與趙家鎮鐘家嶺資源圃中保存的優系。選取當年生健壯無病蟲害的嫩梢，帶回實驗室，置于4℃冰箱保存。

嫩梢經流水沖洗2 h后，在超凈工作臺上用體積分數75％L醇表面消毒1 min，0.1％HgCl₂浸泡滅菌8 min，無菌水沖洗4次，切成0.5～1 cm的小段，接種于B5附加KT0.1～1.0 mg／L和NAA O.1～2.0 mg／L、IBA 0.1～2.1 mg／L不同激素配比的培養基中誘導不定芽，每瓶接5個，每個處理4瓶，重復3次。誘導和繼代的基本培養基為B₅，均添加質量分數0.5％的瓊脂，質量分數2％的葡萄糖和0.08％活性炭。pH 5.8。培養基在121％下高壓菌18 min。培養室溫度為(21±1)℃，光照16 h／d，光照強度400 lx。

1．2 基本培養基的篩選

以莖段為外值體，在B₅、1／28₅、SH、MS、BW、WPM、White 7種基本培養基上進行培養．每處理分別添加KT 0.1 mg／L+IBA 0.5 mg／L，觀察莖段生長情況。40 d后統計外植體成活率。

1．3 低溫、不同光照強度和培養溫度處理

將接種于B₅+KT 0.1 mg／L+IBA 0.5 mg／L培養基上的莖段，分別置于4℃的冰箱內低溫處理0、3、7、14、21、28 d后，取出在室溫下繼續培養40 d。統計分析低溫處理對外植體成活率的影響。

將接種于以上培養基上的莖段，先4℃低溫處理3 d，再分別置于1 600、800、400 lx及黑暗條件下培養40 d，統計分析光照處理對外植體成活率的影響。

將接種在上述培養基上的外植體材料，4℃低溫處理3 d后，再分別置于15、18、21、24、27、30℃光照強度為400 lx的光照培養箱中培養40 d。統計分析培養溫度對外植體成活率的影響。

1．4 不同季節的莖段對不定芽誘導時間和誘導率的影響

分別于2004年和2005年的4月、6月、10月和12月下旬采集當年生和2年生莖段，接種于誘導不定芽培養基(1／2Bs+KT 0.1 mg／L+IBA 0.5 mg／L)進行培養，培養條件采取以上篩選出的最理想條件，即接種后先經4℃低溫處理3 d后，于(21±1)℃室溫和弱光照(400 lx)的條件下培養(下同)。分別于10、15、20、25、30、35、40 d后觀察記錄不定芽誘導和生長情況。

1．5 不同的植物生長調節劑對莖段不定芽誘導效果的影響

將莖段接種于基本培養基B₅，添加KT分別與NAA、IBA的不同濃度組合(表2、3)，進行不定芽誘導，觀察其生長情況。統計分析不同植物生長調節劑及質量濃度組合對不定芽誘導率的影響。

1．6 不同品種與株系的莖段不定芽誘導效果的差異

分別采取當年生優株1號、優株2號、優株3號、優株4號、優株6號、象牙榧、兩性榧、細榧7號、細榧8號、米榧、雄株的幼嫩莖段，接種在B₅+KT0.1 mg／L+IBA 0.5 mg／L培養基上，統計分析不同基因型的香榧不定芽誘導率的差異。

1．7 不定芽的生根誘導與植株再生

將莖段誘導的不定芽轉入1／2 B₅與不同濃度IBA的培養基上誘導生根，篩選出適宜的生根培養基。

1．8 數據統計

所有數據均通過DPS(7.05)版本統計軟件處理，用鄧肯新復極差法在0.05和0.01水平下進行顯著性差異檢驗。并用Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2．1 培養基類型對香榧莖段培養的影響

以莖段為外植體，分別在7種基本培養基上進行培養(表1)，結果顯示，不同培養基對香榧莖段誘導效果差異比較明顯。在這7種培養基中，外植體的成活率為B₅＞1／2 B₅＞MS＞White，其中B₅培養基誘導效果最好，40 d后觀察成活率達40％，成活的外植體顏色鮮綠，生命力強，有不定芽的萌動。在莖段的切口處還可見有少量淡綠色愈傷組織形成：在1／2B₅培養基上外植體生長也較好，顏色鮮綠，也可觀察到有芽的萌動，但成活率僅有18.33％。而在MS培養基上，成活率僅為3.33％，大部分外植體褐變死亡。SH、BW、WPM、White均不能誘導出愈傷，芽也未有萌動，外植體在20－30d后均褐變死亡。

2．2 低溫處理、光照強度與培養溫度對香榧莖段培養的影響

如圖1所示，經過4℃低溫處理3 d的莖段外植體在培養室繼續培養40 d后，有45％還保持鮮綠，有明顯萌動跡象。顯著高于對照以及其他處理的材料(P＜0.05)。但是隨著低溫處理時間的延長，誘導率急劇下降。低溫處理14 d以上的外植體絕大部分先是顏色變為暗綠，有的還出現水浸狀半透明的玻璃化現象，在繼續室溫培養的條件下逐漸褐變死亡，最后僅有一個莖段成活。對照(室溫25℃培養)的成活率為36.67％，大部分材料2周后就出現褐化，逐漸失去萌芽能力。

光照強度也是影響香榧莖段成活率的一個重要因素。在400 lx的弱光培養條件下，莖段外植體的成活率最高。達到62.67％。暗培養的成活率為45％，與400 lx培養條件下的成活率在P＜0.05時差異顯著。隨著光照強度的增加，香榧莖段的褐變率明顯增高，褐化程度也顯著加大(圖2)。

為了提高香榧外植體的成活率，我們對室溫培養的溫度條件也進行了篩選。圖3所示，經過4℃低溫處理3 d后，光照條件為400 lx，培養溫度保持在18～22 ℃的條件下，實驗材料的生長狀況最好，成活率達到71.67％。在24℃的條件下，外植體的成活率開始下降，主要表現在外植體極易發生褐變而死亡。隨著培養溫度的增高，褐變程度加大，當培養溫度超過27℃時，大部分外植體于1周之內發生褐變，逐漸死亡。但在15℃的培養條件下，雖然大部分外植體保持綠色，但是也未生長分化。

2．3 不同時期的莖段離體培養情況

不同時期采集的莖段接種后生長速度不同，以當年生莖段誘導出不定芽的時間較短，平均為24～25d，且生長速度較快。2年生莖段誘導出不定芽的時間相對較長，一般為26～30 d。12月份采集的二年生莖段誘導率偏低，這可能與香榧本身的生長節律有關。

2．4 不同植物生長調節劑對不定芽分化誘導的影響

莖段外植體接種于不定芽誘導培養基3周左右，即可觀察到腋芽開始萌動，顏色鮮綠(圖版-1)。插入培養基部分開始腫脹膨大。20 d后。在切面及葉腋處形成不定芽，有的從膨大的皮孔處產生肥厚的芽，漸漸形成叢生芽(圖版-2)。在不定芽的培養過程中，觀察到再生的叢生芽生長顯著，葉片伸展，節間伸長明顯，植株健壯。經60 d后，統計各處理誘導率(表3)。不定芽在KT質量和NAA的協同作用下誘導效果較好，隨著KT濃度的增加誘導率降低，NAA質量濃度增大則誘導率升高，其中在Bs+KT 0.1 mg／L+NAA 2.0 mg／L時，誘導效果最好，誘導率可達48.33％，且不定芽生長速度較快。將其繼代培養8周，即可生長成3 cm左右的無根苗(圖版-4)，然后轉入生根培養基誘導生根。

為提高不定芽誘導率，對以B₅為基本培養基的KT和IBA組合進行了篩選。在KT質量濃度為0.1～0.5 mg／L，IBA質量濃度為0.1～1.0 mg／L時都能誘導出不定芽。其中KT 0.1 mg／L+IBA 0.5 mg／L的誘導效果最好，不定芽誘導率可達55％。同時還誘導出一些叢生芽。在叢生芽的培養過程中，觀察到再生的叢生芽有明顯的個體差異，有部分單芽生長速度相對較快，個體差異和培養條件的一致性暗示在組織培養過程中可能產生了體細胞變異。為克隆潛在的體細胞變異，篩選了生長速度較快且生長狀況良好的無菌苗，將其在無菌條件下切成1 cm的小段，接種到分化培養基中，進一步擴大繁殖，誘導分化出芽。繼代培養多次后的再生苗各項生長指標未見降低，并且比對照組培苗生長優勢顯著(圖版-4)。

在莖段的組織培養過程中，當KT質量濃度大于0.5 mg／L，IBA質量濃度大于1 mg／L時，許多外植體中部膨大、裂開，于裂口處形成愈傷組織，也有少部分外植體于端部切口處形成愈傷組織，隨后整個莖段都愈傷化。由莖段形成的愈傷組織呈淡黃綠色，質地較為疏松，但在繼續培養中很容易褐變，難以成苗。對此我們將作進一步研究。

2．5 不同品種、株系的莖段不定芽誘導結果

我們在對優株1號、2號、3號、4號、6號、象牙榧、兩性榧、細榧7號、細榧8號、米榧、雄株等11個不同品種、株系的莖段外植體進行培養時發現，在不同的品種或株系之間，不定芽誘導率存在著較為明顯的差別。除雄株的不定芽誘導能力明顯偏高外，優株3號、4號、2號的不定芽誘導率也較高(表5)。說明在當地選育出來的品質優良、產量高、生長健壯的優系，生長勢和莖段的再生能力也較強，在組織培養中也表現出較強的生長優勢。同品種不同株系的香榧不定芽誘導率差異不顯著，但是不同品種之間的不定芽誘導率差異顯著，尤其是雌、雄株之間差異更明顯。在同樣的培養基與激素組合下，雄株易誘導出愈傷組織，雌株易誘導出不定芽。這可能與雌雄株外植體本身所含內源激素的種類和質量濃度水平不同有關，說明基因型的差異決定外植體再生能力的高低。

2．6 不定芽的生根誘導及植株再生

將長到3 cm左右的不定芽切下轉接到生根培養基中(以1／2 B，為基本培養基)，3周后觀察到在附加IBA 0.01～1.0 mg／L培養基上的芽基部變粗，有明顯的根原基形成凸起，逐步長出粗壯的單根(圖版-5、6)。較低的IBA質量濃度有利于香榧不定芽的生根誘導。在IBA質量濃度為0.1 mg／L時，根的誘導率達到了40％(表6)。在IBA質量濃度為0.1～1.0mg／L的范圍時，上部芽的生長明顯加快，但生根能力下降。隨著IBA質量濃度的繼續升高(當IBA質量濃度＞1.0 mg／L時)，不僅生根率下降，幼芽的脫分化能力也增強，容易產生愈傷組織。但這種由非胚起源的愈傷組織在繼代的過程中很容易褐化，無法對它進行進一步再生的誘導。

在香榧組織培養過程中，我們還發現一個有趣而且難以解釋的現象：有個別不定芽在生長過程中出現根莖以上部分存在向下生長的趨勢，即使第2次繼代后，新生的、幼嫩的組織位于植株中間，植株的頂端部分則是繼代前生長發育的較老組織；第3次繼代后，仍然是最靠近根莖部的莖、葉最為幼嫩，顏色較淺，呈黃綠色；而靠近植株頂端的葉片與莖部顏色逐漸變深，呈濃綠色，頂芽沒有生長跡象，植株的伸長主要在靠近幼苗基部的地方(圖版-3)。這種逆反的生長現象似乎表明在香榧莖段的基部也有分生組織的存在。

3 討論

木本裸子植物的組織培養難以成功，尤其是榧屬植物。我們利用香榧莖段為外植體，通過器官發生途徑獲得完整植株，這還是首次報道。

影響香榧莖段不定芽誘導的因素很多。外植體的來源、基因型及植株組織的生長狀況都是影響不定芽再生的重要因素。這種壽命長逾千年的古樹種本身細胞分裂生長緩慢，對環境條件的要求也比較嚴格，不利的條件很容易導致外植體細胞褐變死亡，這也是香榧組織培養難以成功的重要原因之一。影響褐變的因素包括植物種類、年齡、部位以及大小、培養基的配方、光照強度與溫度等等。在我們的研究中發現，香榧試管苗的分化與生長不適于采用常規的組織培養條件，接種后前期3 d的4℃低溫處理，之后以400 lx的弱光照和18～22 ℃培養溫度，能有效地阻滯其褐變，是保證培養成功的關鍵因素。這也與半陰性常綠喬木的苗期與幼樹需要庇蔭管理的生物學特性相符。這種特殊的條件要求與同科的紅豆杉的細胞培養也不相同。

外植體的類型、取材時間、年齡、極性等都是影響離體再生的重要因素。本試驗通過對不同季節采集當年生和2 a生枝梢的培養發現：不同時期的莖段接種后生長速度不同，以4月下旬～6月中旬的當年生莖段分化不定芽時間最短，平均24～25 d即可觀察到，且生長速度最快。這可能與香榧本身的生長節律有關，因為這一時期，正是香榧抽發新枝、花芽萌動時期，此時期的生理活性強，代謝旺盛。

在試驗中還觀察到不同基因型的香榧所要求的最佳培養基及對植物生長調節劑的敏感性均有所差異，莖段不定芽的再生能力也有較大差異。有的基因型榧樹還存在更易褐化的特點，如兩性榧、米榧和細榧7號、8號，即使附加質量分數0.08％的活性炭也較難控制其褐變。這可能是因為這些品種含有較多的酚類物質所致。王關林等在不同基因型槐樹的組織培養研究中也得到了類似的結果。

一般而言，植物的地上部分都具有向上生長的趨勢，植物頂端、梢端都是新生的幼嫩部分。但在香榧組織培養過程中出現的枝梢背地性生長的現象十分罕見。分生組織從頂芽移位于根莖部，是由于組織培養中，生長環境的改變所致，還是由于激素對其影響所導致的變異，抑或是在植物的進化過程中，已經丟失的一種生物性狀，而在這種古老的樹種還有所保留，其機制值得進一步深入研究。

生長調節物質可改變植物離體再生的方向。對香榧而言，尋求合適的激素組成和配比，對提高離體再生頻率尤為重要。較低質量濃度的細胞分裂素，與適當質量濃度的生長素IBA和NAA配合使用，有利于香榧莖段不定芽的誘導。若生長素質量濃度高于1 mg／L則令其脫分化為愈傷組織。實驗成功獲得了完整植株，從莖段接種到植株生根歷時6個月，期間以植株生根所需時間較長，還需要進一步優化。

4 結論

香榧莖段的分化與生長不適于采用常規的組織培養條件，接種后前期3 d的4 ℃低溫處理、之后以400 lx的弱光照和18～22℃溫度培養，能有效地阻滯其褐變，是保證培養成功的關鍵因素。在適合的無機鹽、有機物以及激素質量濃度配比的培養基中，香榧莖段不定芽誘導率可達到55％，根的誘導率最高達到40％。