甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反義基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化煙草的研究

摘 要：用限制性內(nèi)切酶從目的基因供體質(zhì)粒pBI－aPG上切下大小約2.3 kb的目的基因，將它定向連接在受體質(zhì)粒pCAMBIA2301載體上，構(gòu)建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反義基因植物表達(dá)載體pCB－aPG。采用直接轉(zhuǎn)化法將pCB－aPG導(dǎo)人根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404，采用該菌株對(duì)普通煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。在Kanamycin選擇壓力下獲得的煙草轉(zhuǎn)化不定芽和完整植株，經(jīng)過GUS基因組織化學(xué)法檢測(cè)以及PCR方法鑒定，證實(shí)了該反義基因已導(dǎo)人煙草基因組中。此項(xiàng)研究為下一階段用該反義基因轉(zhuǎn)化甜瓜品種以改良甜瓜果實(shí)耐貯運(yùn)性打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甜瓜；PG；反義基因；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-9980(2007)04-492-04

在全世界大宗水果的排名中，甜瓜居于第九位，是全世界普遍栽培的、經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的重要園藝作物。然而大多數(shù)甜瓜屬于呼吸躍變型果實(shí)，達(dá)到生理成熟的甜瓜果實(shí)采收后會(huì)很快出現(xiàn)呼吸高峰，果肉迅速變軟，商品性和貯運(yùn)性大大降低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆哈密瓜在銷售地的短期貯藏?fù)p失達(dá)15％，甘肅黃河密甜瓜運(yùn)銷過程中的損耗高達(dá)29.3％。這給種植者和經(jīng)營(yíng)者都帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。也在一定程度上影響了甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

甜瓜果實(shí)的成熟軟化與果膠的降解有重要的關(guān)系。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是一種細(xì)胞壁結(jié)合蛋白，可以催化果膠分子中a-1，4-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)軟化。構(gòu)建PG反義基因植物表達(dá)載體，通過基因工程手段導(dǎo)入植物體內(nèi)，可以大幅度降低PG含量，在一定程度上緩解果實(shí)軟化．達(dá)到耐貯運(yùn)的目的。在番茄上已有報(bào)道，并具有良好的商業(yè)化前景。在甜瓜中，未見類似報(bào)道。我們?cè)谇捌谘芯抗ぷ髦锌寺〉揭粋€(gè)甜瓜PG基因，作者的目的就是構(gòu)建其反義基因植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化模式植物煙草以驗(yàn)證該植物表達(dá)載體的可用性，以期為下一階段轉(zhuǎn)化甜瓜，改善其貯運(yùn)性奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 材料

質(zhì)粒pBI-aPG、pCAMBIA2301、大腸桿菌菌株DH5ct和農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保存。各種限制性內(nèi)切酶、DNA marker購(gòu)自上海生工公司；CIP、T4DNA連接酶購(gòu)自Promege公司。

1．2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindⅢ從目的基因供體pBI-aPG上切下3端加有CaMV35S啟動(dòng)子和5′端加有NOS終止子的PG反義嵌合基因35Sp-aPG-NOSt(約2.3 kb)，將其插到相同酶切并進(jìn)行磷酸化的線性pCAMBIA2301質(zhì)粒載體上，從而構(gòu)建成植物表達(dá)載體pCB-aPG(圖1)。

1．3 重組質(zhì)粒的篩選及鑒定

提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行電泳滯后帶檢測(cè)。從電泳產(chǎn)生滯后帶的重組質(zhì)粒中隨機(jī)挑取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。對(duì)PCR鑒定呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將構(gòu)建好的該反義基因植物表達(dá)載體命名為pCB-aPG。

1．4 pCB-aPG轉(zhuǎn)化煙草

采用直接轉(zhuǎn)化法將pCB-aPG導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404t81。提取質(zhì)粒翻，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。煙草的轉(zhuǎn)化采取葉盤法，對(duì)經(jīng)抗生素篩選且在生根培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的完整植株進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2．1 DCB-aPG植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的DBI-aPG小片段和載體pCAMBIA2301進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，取250 txL連接產(chǎn)物涂在附加有75 mg／LKana的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)后，平板上生長(zhǎng)15個(gè)白色的單菌落。而對(duì)照(以ddH₂O替代連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài))平板上沒有長(zhǎng)出菌落。

隨機(jī)挑取處理平板上的單菌落進(jìn)行電泳滯后帶鑒定，用pCAMBIA2301質(zhì)粒DNA做對(duì)照(圖2)。結(jié)果表明，隨機(jī)挑取的4個(gè)菌落的電泳帶均比對(duì)照滯后。取滯后帶質(zhì)粒為模板，用特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明(圖3)，重組質(zhì)粒PCR可以獲得約1200 bp的電泳條帶，與預(yù)期帶大小一樣。隨機(jī)挑取一個(gè)PCR陽性質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和HindⅢ雙酶切．切下了大小約2.3 kb的預(yù)期片段。同時(shí)，對(duì)挑取的質(zhì)粒進(jìn)行Xba I和Sac I雙酶切，也切下了預(yù)期大小為1.2 kh的片段(圖4)。通過上述幾種方法檢測(cè)，證明目的片段已經(jīng)整合進(jìn)載體質(zhì)粒中，命名重組質(zhì)粒為pCB—aPG。

2．2 重組質(zhì)粒pCB-aPG轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

采用直接轉(zhuǎn)化法，用重組質(zhì)粒pCB-aPG轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌LBA4404，在篩選培養(yǎng)基(YEP+Kan75 mg／L+Str 25 mg／L+Rif 25 mg／L)上獲得了20個(gè)菌落，對(duì)照組(僅有農(nóng)桿菌LBA4404)無菌落形成。這說明pCB-aPG已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中。從長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌落的平板上各隨機(jī)挑取2個(gè)分隔良好的單菌落提取質(zhì)粒，用克隆PG基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果都擴(kuò)增出了1.2 kb的DNA分子片段(圖5)，說明轉(zhuǎn)化獲得成功。

2．3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草

經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的煙草葉盤在選擇分化培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，處理的外植體在選擇培養(yǎng)基上大都能誘導(dǎo)出不定芽叢，而對(duì)照外植體則表現(xiàn)黃化．無不定芽產(chǎn)生，停止生長(zhǎng)。將不定芽轉(zhuǎn)入到附加Kan 100 mg／L的生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4周后，假陽性芽逐漸自下而上褪綠死亡，轉(zhuǎn)化芽則分化生根，正常生長(zhǎng)。將完整植株進(jìn)行GUS的組織化學(xué)法鑒定，得到了染色反應(yīng)(圖版-2～4)。提取具有GUS活性的完整植株DNA，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增得到預(yù)期大小的特異性片斷(1.2 kb)，并與陽性對(duì)照具有一致的PCR特異性擴(kuò)增條帶，而作為陰性對(duì)照的未轉(zhuǎn)基因煙草葉片總DNA的PCR沒有特異性擴(kuò)增條帶(圖6)。證明煙草轉(zhuǎn)化成功。

3 討論

甜瓜果實(shí)硬度是果實(shí)品質(zhì)構(gòu)成要素之一，與采后貯藏運(yùn)輸特性有密切關(guān)系，保持甜瓜果實(shí)硬度是提高甜瓜貨架期的有效途徑之一。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PG在果實(shí)軟化過程中起了重要作用。通過反義基因技術(shù)，一方面，可以有效地降低植物體內(nèi)PG含量，在一定程度上抑制果實(shí)軟化，提高果實(shí)貨架期：另一方面，由于PG活性被很大程度地抑制，果膠降解減慢，較好地維持了果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使病源微生物不易侵入果實(shí)，從而增強(qiáng)抗病性。同時(shí)，果實(shí)更耐機(jī)械損傷，抗裂果。因而，我們擬通過遺傳轉(zhuǎn)化手段，將PG反義基因?qū)胩鸸希嘤唾A運(yùn)的甜瓜品種，具有重要的意義。

我們?cè)谇捌诠ぷ髦校瑯?gòu)建了1個(gè)植物表達(dá)載體pBI-aPG，在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)揮了重要的作用。但是這個(gè)植物表達(dá)載體的構(gòu)建是去除了質(zhì)粒載體pBll21中的gus基因，代之以PG基因而得的。去除了gus基因，一方面質(zhì)粒相對(duì)較小，容易轉(zhuǎn)化；但另一方面，由于去除了報(bào)告基因，在后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化工作中不能用簡(jiǎn)便，快捷，靈敏的GUS組織化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)，給研究工作帶了極大的不便。所以有必要對(duì)pBI-aPG進(jìn)行改造，重新添加上GUS報(bào)告基因。

構(gòu)建好植物表達(dá)載體pCB-aPG后，我們首先轉(zhuǎn)化模式植物煙草，檢測(cè)載體構(gòu)建是否正確。在煙草轉(zhuǎn)化過程中，通過抗生素Kan篩選、GUS組織化學(xué)法和PCR檢測(cè)，我們分別鑒定了NPTⅡ選擇基因、gus報(bào)告基因和PG目的基因，也證明了植物表達(dá)載體pCB-aPG構(gòu)建正確，并具有可用性。此研究為進(jìn)一步開展甜瓜果實(shí)耐貯運(yùn)性基因改良打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從供體質(zhì)粒pBI-aPG上切下目的基因，將其連接到受體質(zhì)粒pCAMBIA2301上，通過抗生素篩選、滯后帶、PCR、及雙酶切鑒定，證明成功構(gòu)建了甜瓜PG反義基因植物表達(dá)載體pCB-aPG。用直接法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404，組成工程菌pCB－aPG／At．LBA4404。用所構(gòu)建的工程菌轉(zhuǎn)化煙草，通過抗生素選擇、GUS活性鑒定以及PCR分子檢測(cè)證明獲得轉(zhuǎn)基因煙草，同時(shí)也證明所構(gòu)建的植物表達(dá)載體oCB-aPG的目的基因、報(bào)告基因及選擇標(biāo)記基因完好，并且能夠正確表達(dá)，為下一步的甜瓜作物的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了基礎(chǔ)。