闊葉獼猴桃遺傳轉化技術參數(shù)的優(yōu)化

摘 要：為了提高闊葉獼猴桃的遺傳轉化效率，以闊葉獼猴桃葉柄為試材，通過根癌農桿菌介導法進行了遺傳轉化技術參數(shù)的研究。結果表明，葉柄預培養(yǎng)3～4 d、用農桿菌懸浮液(D_600nm值0.5)感染10 min、共培養(yǎng)48 h、共培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中加入200 μmol／L乙酰丁香酮處理可以獲得較高的gas基因表達率。在供試的1200個葉柄中獲得了49個抗性芽，轉化頻率為4.1％。對轉基因抗性材料進行PCR檢測和gus基因組織化學染色，證實了外源基因已整合到闊葉獼猴桃的基因組中，并得到穩(wěn)定表達。

關鍵詞：闊葉獼猴桃；遺傳轉化；根癌農桿菌；gus基因

中圖分類號：S663．4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-553-04

闊葉獼猴桃(Actinidia latifolia Merr.)果實可食用，也適合制作果汁和果酒。最可貴的是其鮮果中維生素C含量高達9.4～21.4 mg／g，居獼猴桃之首。雖然闊葉獼猴桃的開發(fā)利用和研究價值很高，但其果實小、外觀差等性狀限制了它的商品性，所以有待于利用現(xiàn)代生物技術進行改良育種，以適應人們對健康營養(yǎng)型果品的需求。獼猴桃的遺傳轉化已有一些研究報告，但主要集中在栽培種美味獼猴桃(Actinida deliciosa var.delicilsa)上。關于闊葉獼猴桃的遺傳轉化，畢靜華等以闊葉獼猴桃葉片為試材，通過農桿菌介導法進行了闊葉獼猴桃的遺傳轉化，探討了闊葉獼猴桃的抗生素敏感性，同時獲得了轉基因植株，但是轉化率較低。為了提高闊葉獼猴桃的遺傳轉化效率，進行闊葉獼猴桃的遺傳轉化技術參數(shù)的優(yōu)化是非常必要的。試驗以闊葉獼猴桃的葉柄為轉化受體，探討了闊葉獼猴桃遺傳轉化的各項技術參數(shù)，為進一步進行控制目標性狀的目的基因導入奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 植物材料和培養(yǎng)條件

材料為本實驗室建立并保存的闊葉獼猴桃試管苗，培養(yǎng)在不含激素的1／2MS^[8]培養(yǎng)基上，每4周繼代1次。取4周苗齡的無菌苗幼嫩葉柄(約長0.5cm)作為受體進行遺傳轉化試驗。愈傷組織和不定芽再生培養(yǎng)基為1／2MS+O.1 μmol／L NAA+5 μmol，LZeatin，生根培養(yǎng)基為1／2MS+1 μmol／L NAA。所有培養(yǎng)基均附加7 g／L的瓊脂粉和20 g／L的蔗糖，用0.1 mol幾的HCl或Na0H調pH值至5.8，在12l℃(1.2 kg／cm²)高壓滅菌20 min。高壓滅菌的培養(yǎng)基，冷卻到50℃左右，加入過濾滅菌的抗生素和乙酰丁香酮，混勻、分裝備用。材料在(25±2)℃，光周期16／8 h，光照強度40 μmol／m²-s的條件下培養(yǎng)。

1．2 質粒及菌株

轉化所用的質粒為pBll21，含CaMv 35S啟動子調控的β－葡糖苷酸酶(gus)報告基因和抗卡那霉素(Kan)篩選的新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因。質粒通過凍融法轉入根癌農桿菌菌株EHAl05中。

1．3 方法

1．3．1 農桿菌的培養(yǎng)和活化 選取包含質粒pBll21的農桿菌EHAl05單菌落。接種到含Kan50 mg／L、鏈霉素(Str) 50 mg／L的5 mL液體YEP培養(yǎng)基中，180 r／min 28 cC振蕩培養(yǎng)24 h。取該菌液2 mL加入到40 mL含同樣抗生素的新鮮液體YEP培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h至對數(shù)生長期，然后于4000 r／min 4℃離心15 min，沉淀用液體1／2MS(pH5．2)等體積懸浮后備用。

1．3．2 根癌農桿菌對外植體的浸染與共培養(yǎng) 將切好的葉片直接浸入農桿菌懸浮液中浸泡，其間不斷振蕩，使農桿菌能與外植體充分接觸。之后取出外植體用無菌濾紙吸去多余菌液，置于含有200 μmol／L乙酰丁香酮(AS)的再生培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d，然后取出，用無菌水沖洗3次，接種到含Kan 20mg／L、Cef 300mg／L的再生培養(yǎng)基上，每2周繼代1次，暗培養(yǎng)21 d后轉到光下培養(yǎng)。

1．3．3 闊葉獼猴桃基因組DNA的提取 取一小片抗性芽葉片，置于1.5 mL的離心管中，加液氮研磨成糊狀。然后加入預熱到65℃的SDS提取液，65 ℃水浴30 min，并不斷輕輕搖動。冷卻至室溫后加入等體積酚／氯仿混勻，12 000 r／min離心5 min，取上清液，重復2～3次，小心將上清液移入新的離心管中，加入等體積的氯仿后混勻，12 000 r／min離心5 min。將上清液轉入新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇和1／10體積3 mol／L NaAc(pH 5.2)，室溫靜置10 min，再12 000 r／rain離心5 min。70％乙醇漂洗沉淀，37℃晾干后，溶于含RNase的TE，取3 μL電泳，其余-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?1．3．4 PCR分析 從SDS法快速提取的闊葉獼猴桃的基因組DNA中，取約100 ng基因組DNA為模板，進行PCR擴增。以未經農桿菌感染的試管苗葉片基因組DNA為陰性對照，同時設重組質粒pBll21為陽性對照。根據(jù)載體特有的NPTⅡ基因(約長500bp)兩端序列設計引物，上游引物UPl，5'-GTrCTIqqq'GTCAAGACCGACC一3；下游引物DPI，5’-CAAGCTCTTCAGCAATATCA CG-3'(由上海生物工程公司合成)，以UP2和DP2為引物進行特異擴增檢測。PCR反應在PTC-200 PeltierThermal Cycler上進行。25 IxL PCR反應體系包括：10 μmol／L的UPl和DPI各1 IxL，10×PCR反應緩沖液2.5 μL，25 mmol／L MgCl₂ 1.5 μL，2.5 mmol／LdNTPs 2 μL，2 μL Taq DNA聚合酶(TaKaRa，Japan)。反應條件為94 ℃預變性5 min，94℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，進行30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．3．5 gus基因表達的組織化學分析 gts基因瞬時表達的檢測采用Jefferson等的方法進行。

2 結果與分析

2．1 外植體預培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

將切好的葉柄置于不含任何抗生素的再生培養(yǎng)基上，分別預培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 d，然后用D_600nm值為0.5的農桿菌懸浮液浸染后培養(yǎng)，然后測定gus瞬時表達率和永久表達率。結果表明：預培養(yǎng)時間對闊葉獼猴桃葉柄的轉化效率有一定的影響(圖1)。葉柄預培養(yǎng)3 d和4 d后進行轉化能夠獲得較高的gus瞬時表達率，有抗性愈傷組織和抗性芽形成，但形成率差異較大。為了避免假陽性的存在影響轉化效果的評價，采用gus基因永久表達率來衡量轉化效率。預培養(yǎng)5 d的處理中gus基因永久表達率(16.7％)明顯低于3、4 d預培養(yǎng)處理的39％，這可能是由于5 d預培養(yǎng)時愈傷組織的形成已經啟動，假轉化體比例增大，從而降低了遺傳轉化率。預培養(yǎng)時間再延長，假轉化體比例迅速增大，所以盲目延長預培養(yǎng)時間只會增加工作量，而轉化植株的數(shù)量增加甚微。因此，預培養(yǎng)時間確定為3～4 d較為合適。

2．2 農桿菌感染時間對轉化效率的影響

將切好的葉柄置于含抗生素的再生培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d，然后用D_600nm值為0.5的農桿菌懸浮液，分別浸泡30 s、5 min、10 min、15 min、30 min后培養(yǎng)。結果表明(表1)，上述5個處理的gu，s永久表達率分別為25.0％、45.5％、52.7％、38.4％、16.7％，可見農桿菌浸染10 min效果最好。感染時間超過10 min時gus永久表達率急劇下降，當感染時間延長到30min時gus永久表達率降低到16.7％。gus瞬時表達率的曲線變化趨勢同gus永久表達率。因此農桿菌浸染闊葉獼猴桃葉柄的時間應控制在10 min左右。

2．3 農桿菌濃度對轉化效率的影響

在農桿菌菌液D_600nm值為0.1、0.2、0.5、1.0、1.5的5個處理中。最高的gus瞬時表達率(88.4％)和最高的gus永久表達率(47.5％)都發(fā)生在D_600nm0.5的處理中(表2)。D_600nm太小，農桿菌感染的幾率下降；D_600nm太大，導致外植體切口褐化甚至死亡，從而降低遺傳轉化率。D_600nm為0.5是闊葉獼猴桃葉柄遺傳轉化中最適的農桿菌懸浮液濃度。

2．4 共培養(yǎng)時間對轉化效率的影響

表3表明，共培養(yǎng)時間對闊葉獼猴桃葉柄的遺傳轉化有顯著的影響。共培養(yǎng)48 h時gus基因的瞬時表達率和永久表達率分別為90.9％、49.7％，是所有處理中轉化效率最高的。觀察發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)24 h，農桿菌菌落生長量較少，生長面積沒有超出外植體在培養(yǎng)基上放置的位置，只有移出外植體才能在培養(yǎng)基表面看到菌斑：共培養(yǎng)48 h和72 h后，在外植體的周圍已可見明顯菌斑；共培養(yǎng)96 h后，農桿菌生長旺盛，面積較大；共培養(yǎng)120 h后，農桿菌生長過剩幾乎淹沒外植體。當共培養(yǎng)時間超過48 h時，外植體的死亡率隨著共培養(yǎng)時間的延長而升高，當共培養(yǎng)時間達120 h時．死亡率達28.5％。因此48 h被認為是最佳的共培養(yǎng)時間。

2．5 AS添加方式對轉化效率的影響

在農桿菌培養(yǎng)階段添加乙酰丁香酮，并不能提高闊葉獼猴桃葉柄的遺傳轉化效率，農桿菌活化時不添加而在共培養(yǎng)時添加200 μmol／L乙酰丁香酮，轉化效果最好，gus瞬時表達率和gus永久表達率同時達到最高值，分別為91.5％、49.8％，同時死亡率最低(14.3％)。共培養(yǎng)時培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮，外植體的死亡率明顯降低(表4)。

2．6 抗性芽的篩選培養(yǎng)

在葉柄外植體的遺傳轉化中，經首次抗生素篩選培養(yǎng)，部分外植體逐漸褐化死亡；有些外植體慢慢地長出抗性愈傷組織。經過2～3個月的培養(yǎng)，抗性愈傷組織分化出不定芽(圖版-A)，但不定芽再生頻率很低。在含Kan 50 mg／L、Cef 300 mg／L的篩選培養(yǎng)基上，假陽性不定芽很快就會變成白色，最后逐漸死亡。存活的抗性芽保持綠色并正常生長(圖版B)。在農桿菌感染的1200個葉柄外植體中獲得了49個抗性芽，轉化頻率為4.1％。

2．7 PCR檢測與gus基因表達

轉基因植株的PCR特異擴增檢測結果如圖4所示，陽性對照(pBll21)和轉基因材料都能擴增出500 bp左右的特異條帶，而未轉化材料不能擴增出任何條帶，說明外源NPTⅡ基因已經整合到獼猴桃基因組中。

隨機抽取抗性芽葉片，采用Jefferson等的方法進行gas基因表達的檢測。從抗性芽葉片組織染色結果來看，抗性組織和葉片呈現(xiàn)藍色(圖版-C、D)，這說明gas基因已經轉入闊葉獼猴桃的基因組中， 并得到穩(wěn)定表達。

3 討論

外植體在農桿菌懸浮液中的浸泡時間是影響轉化效率的重要因素。浸泡時間太短，農桿菌未接種到傷口面，不能完成轉化；時間太長，則農桿菌毒害造成外植體褐化甚至死亡，也會導致篩選時抑菌困難，造成污染。有研究報道農桿菌感染時間一般不要超過30 min。在本研究中農桿菌菌液浸染闊葉獼猴桃葉柄的時間應控制在10 min，這時gas瞬時表達率和永久表達率可以達到最高值。農桿菌附著后并不能立刻轉化，只有在創(chuàng)傷部位生活超過16 h的菌株才有轉化功能，但如果共培養(yǎng)時間太長，植物細胞易受毒害而死亡。試驗結果顯示，對于闊葉獼猴桃葉柄來說共培養(yǎng)48 h效果最好。根癌農桿菌Ti質粒的Vir區(qū)對T-DNA的轉移起到介導作用。根癌農桿菌Vir基因的表達及其表達水平直接影響到轉化效率。植物受傷細胞分泌的某些酚類化合物如乙酰丁香酮(AS)對根癌農桿菌Vir基因的表達有誘導作用。這可能是不同植物及同一植物的不同基因型、不同生理狀態(tài)等差異造成的。對闊葉獼猴桃葉柄來說，農桿菌活化階段添加AS并不能提高轉化效率，農桿菌活化時不添加AS而共培養(yǎng)時添加200μmol／L AS的處理效果最好，gus瞬時表達率和gus永久表達率同時達到最高值，分別為91.5％、49.8％，同時死亡率最低只有14.3％。在共培養(yǎng)時添加AS．外植體的死亡率明顯降低。