小西葫蘆黃花葉病毒外殼蛋白基因導入西瓜的遺傳轉化

摘 要：研究了西瓜品種ZKM的再生體系和農桿菌介導小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic uirus．ZYMV)的外殼蛋白(cp)基因導入西瓜的遺傳轉化體系。結果表明，質量分數0.6％瓊脂是適宜種子萌發的基本培養基，切取5 d齡的西瓜無菌苗子葉為外植體，接種在MS+BA 2.0 mg／L誘導培養基上，誘導不定芽效率最高。選用75 mg／L卡那霉素篩選西瓜抗性芽較為合適，外植體經預培養2－3 d，菌液濃度以OD_600nm值為0.4，共浸染10min有利于提高西瓜轉化的效率。經PCR檢測，ZYMVcp基因已經導入西瓜植株，轉化頻率為0.15％。

關鍵詞：西瓜；外殼蛋白；遺傳轉化

中圖分類號：S665．1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2007)04-496-06

病毒病是西瓜的主要病害之一。近年來，西瓜病毒病已經對西瓜的生產構成嚴重威脅。研究者發現，危害我國北方地區的病毒優勢種為小西葫蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)和西瓜花葉病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)，ZYMV常與WMV、黃瓜花葉病毒(Cucum6er mosaic virus，CMV)等一起混合浸染，加重WMV和CMV的危害。目前能夠用于雜交選育抗病毒品種的西瓜資源極少且野生性狀突出。因此，應用轉基因技術在優良親本中增加抗病毒性狀，培育抗病毒的新品種是解決西瓜病毒危害的有效途徑。

西瓜遺傳轉化體系的建立是基因轉化獲得新種質的關鍵。1994年，韓國學者Choi等報道用農桿菌轉化西瓜子葉獲得了GUS基因表達植株。我國王慧中等、黃學森等開展了西瓜轉基因抗病毒的研究工作。韓國學者Park等通過轉基因獲得抗黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus，CGMMV)的西瓜砧木。西瓜的遺傳轉化相當難，常因受體基因型不同，轉化頻率很低。我們通過對西瓜再生體系和根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系進行研究，以期建立一個優化的西瓜遺傳轉化體系，將ZYMV外殼蛋白(cp)基因通過農桿菌介導法導入西瓜植株。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料 西瓜親本材料ZKM由中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜育種組提供。

1．1．2 細菌菌株 含有ZYMV cp基因和NPTⅡ基因的重組質粒pBZCP5的根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌株由本生物技術中心保存。

1．2 方法

1．2．1 外植體的獲得西瓜種子剝去種皮后，置超凈工作臺上用體積分數70％酒精消毒30 s，無菌水沖洗2次，再用質量分數0.1％HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗5次．然后用無菌濾紙吸干水分。接種在質量分數0.6％瓊脂、1／2MS、MS的培養基上選擇合適的基本培養基。pH值均為5.8。25℃黑暗條件下，培養2 d，再轉入16 h光照，8 h黑暗條件下培養。為選擇最佳苗齡，選取接種3～6 d苗齡的子葉作為供試材料。

1．2．2 愈傷組織與不定芽的誘導 從供試材料上切取子葉，橫切為二，去其頂端，表面朝上移入誘導培養基。以MS為基本培養基，分別添加BA、IAA、AgNO₃、NAA等9種激素組合進一步篩選最佳誘導不定芽分化的培養基。4周以后觀察外植體的生長情況。

1．2．3 卡那霉素(Kan)濃度的篩選 將外植體接種到添加不同質量濃度的Kan(0、25、50、75、100、125mg／L)的誘導培養基MS+2.0 mg／L BA上進行培養，4周以后觀察外植體的生長情況。

1．2．4 預培養時間 外植體接種到MS+BA 2.0 mg／L培養基上，通過0、1、2、3、4、5 d預培養，4周以后觀察外植體的生長情況。

1．2．5 農桿菌的活化 參照王關林等方法，在轉化前1 d，挑取包含pBZCP5質粒的農桿菌(A．tume．faciens)LBA4404單菌落，接種到含Kan 50 mg／L、利福平(Rif)50 mg／L的50 mL YEB液體培養基中，180 r／min，28℃振蕩培養過夜至菌液濃度OD_600nm為0.4左右，然后4 000 r／min離心10 min，收集菌體，將菌體用相同體積的MS液體培養基懸浮備用。

1．2．6 外植體的轉化 將外植體浸入懸浮菌液中10 min左右，用無菌濾紙吸干菌液，轉接到MS+BA2.0 mg／L培養基上，與含pBZCP5的根癌農桿菌LBA4404在暗處共培養2 d。然后轉入篩選培養基MS+BA 2.0 mg／L+Kan 75 mg／L+cef 500 mg／L中，16h光照，8 h黑暗條件下進行選擇培養．篩選抗性芽。4周后，將分化出不定芽的外植體轉入伸長培養基MS+KT 0.2 mg／L+Kan 60 mg／L+cef 400 mg／L進行伸長培養。當不定芽長到2 cm以上時，切下并移入生根培養基MS+NAA 0.2 mg／L+Kan 30 mg／L+cef 200 mg／L中進行生根培養。

1．2．7 PCR檢測 選取轉基因西瓜的抗性芽，并以非轉基因植株作為陰性對照，采用CTAB法提取植物基因組DNA，進行PCR擴增，方法參見文獻。以鑒定ZYMV的CP基因是否整合到植物基因組中。

2 結果與分析

2．1 不同培養基對西瓜種子萌發的影響

在種子萌發過程中，分別用3種基本培養基進行培養。5 d以后發芽情況見表1。

隨著培養基營養元素濃度的增大，種子的萌芽率從92.3％降低到88.0％，畸形芽率從1.0％增加到8.0％。子葉顏色從翠綠色變為深綠色，而且在MS培養基上培養的無菌苗發芽時間較前2者推遲1～2 d。

2．2 苗齡對不定芽誘導的影響

在實驗中以苗齡作為主要因素，同時根據子葉顏色和生長狀態來確定子葉作為外植體的最佳時間(表2)。

苗齡對外植體誘導不定芽有很大的影響，當子葉為黃色就轉入誘導培養基時，大部分子葉塊顏色不繼續轉綠，而且邊緣會變褐，最后死亡，誘導率很低，僅為4.2％。子葉轉為淺綠色，轉入誘導培養基以后，分化不定芽數量少。而子葉轉為綠色，再轉到誘導培養基培養，3 d以后，子葉塊就會膨大，而且在近軸端出現瘤狀突起，再過3周陸續分化出不定芽。而當子葉塊顏色變成深綠時轉到誘導培養基，3 d后子葉塊也會膨大，但有不同程度的玻璃化，分化不定芽的數量也很少，而且有畸形芽出現。

2．3 不同激素組合對不定芽誘導的影響

外植體分別置于以下9種不同的激素組合培養基上，對不定芽的誘導結果見表3。在這9種不同激素組合的培養基中，培養1周后外植體均有不同程度的膨大，而且從傷口處不同程度地產生白色、淡黃色以及綠色疏松的愈傷組織，但大部分產生在臨近下胚軸一端，切口的另一端少有愈傷組織形成，3周以后不定芽會陸續出現，出芽部位大多集中在外植體臨近下胚軸一端的切口邊緣與維管束的交接處，但并不是通過愈傷組織形成的不定芽，而是直接形成的不定芽。另一端很少有芽形成。各種激素組合均能誘導不定芽。BA 2.0 mg／L時，子葉誘導不定芽的效果最好，誘導率達到81.25％。添加0.1 mg／L和0.3 mg／L的IAA、NAA僅僅增加愈傷組織的形成，并未促進不定芽的分化，而1.0 mg／L IAA、NAA對芽的分化反而有抑制作用。添加AgNO₃也未見不定芽分化率提高，對芽分化的影響不大。

2．4 Kan質量濃度的篩選

在進行轉化操作之前，對受體材料進行抗生素敏感性測定是十分必要的。在轉化過程中，既要抑制農桿菌過度生長，防止細菌過度生長污染外植體，又不能影響植物的正常生長。Kan濃度的篩選見表4。

Kan濃度對外植體的分化作用很明顯，濃度越高抑制作用越強，當Kan濃度為125 mg／L時，外植體雖然膨大但不會形成愈傷組織，隨著培養時間的延長，逐漸黃化死亡，芽分化頻率為0。Kan濃度為100 mg／L時，外植體膨大有愈傷組織形成，但切口處出現褐化，不能分化出不定芽，4周以后，子葉切塊死亡。Kan濃度為75 mg／L時，分化頻率達43.8％，子葉切塊有部分死亡。當Kan濃度低于75 mg／L時，不定芽分化數量增加。因此，以Kan濃度為75 mg／L作為西瓜遺傳轉化的篩選濃度。

2．5 預培養對轉化效率的影響

在本試驗中，外植體經過2～3 d預培養，抗性芽的分化頻率較高達3.5％(表5)。此時，近胚軸端出現瘤狀突起，與農桿菌共浸染，轉化植株數量多，而預培養時間稍長，外植體在農桿菌浸染之前已形成芽原基，造成“假陽性”植株增加。而未經過預培養的外植體與農桿菌共培養，農桿菌浸染后，切口處容易褐化，而且在外植體周圍容易滋生細菌，抑制外植體的生長，較之預培養的外植體更易死亡。

2．6 PCR檢測

選用2000多個子葉作為外植體，按1．2．5方法對西瓜外植體進行轉化。最后在篩選培養基上成苗36株，提取抗性芽的基因組DNA，并以非轉基因西瓜植株為對照，進行PCR檢測，只有3株抗性芽擴增出與目的基因大小一致的條帶，約為1200 bp(圖1)。結果表明ZYMVcp基因已經整合到植物基因組中，轉化頻率為0.15％。

3 討論

3．1 基本培養基

采用基本培養基誘導西瓜種子萌發，不同文獻報道各不相同。王慧中等采用質量分數0.8％的瓊脂培養基，張明方等采用質量分數0.7％的瓊脂培養基誘導西瓜種子萌發，王春霞等、郝立新等、牛勝鳥等、Park等采用1／2MS培養基誘導西瓜種子萌發，張志忠等、Choi等采用MS。本試驗將種子在質量分數0.6％的瓊脂培養基上培養就能很好地萌發。筆者認為在種子萌發時期，只要溫度、濕度條件適宜，不需添加營養元素，胚積累的營養物質就能夠滿足其萌發和前期生長，而且畸形芽出現的幾率很小。

3．2 西瓜苗齡

子葉苗齡是影響誘導不定芽的主要因素之一，不同苗齡的子葉內在生理狀態和分化水平等方面存在差異，這些差異導致外植體誘導不定芽的效率不同。對于西瓜的最佳苗齡，研究結果不盡相同。王春霞等㈣認為2 d齡無菌苗子葉為最佳外植體，Park等認為3 d齡無菌苗子葉為最佳外植體，郝立新等、牛姍姍等選取6 d齡無菌苗子葉作為最佳外植體，而大多文獻認為西瓜5 d齡無菌苗子葉最適于作為外植體。這些差異也許與不同研究者采用的材料，培養溫度不同有關。筆者初期對不同基因型西瓜設定不同溫度誘導種子萌發和子葉生長發現，作為最佳外植體的子葉苗齡會相差1～2 d，因此認為最佳苗齡也受基因型和溫度的影響。

3．3 不同激素組合

激素是子葉能否誘導高頻率不定芽的另一重要因素。本試驗在2 mg／L BA的基礎上添加了不同質量濃度的IAA、NAA，但結果只是促進愈傷組織的增加并未使不定芽的分化率提高。這與Choi等、Comoton等、張興平的研究結論一致：他們指出5～10 Ixmol／L BA(相當于1～2 mg／L BA)是誘導西瓜子葉不定芽發生的最佳激素濃度，添加低濃度IAA或NAA會抑制不定芽的分化。而王春霞等、Park等、張明方等研究發現在1～2 mg／L BA的基礎上，添加0.2 mg／L IAA，不定芽的分化頻率最高。

AgNO₃是乙烯合成的抑制劑，可以有效防止植物細胞在離體培養中乙烯的積累，促進器官發生以及離體植株的再生。宋道軍等添加5 mg／L的AgNO₃不定芽誘導率提高10％，王春霞等添加50 μmol／L的AgNO₃(相當于8.5 mg／L AgNO₃)促進不定芽的分化。本試驗研究發現添加3-4 mg／L AgNO₃對不定芽分化的促進作用較IAA和NAA效果更加明顯，但也并不比單獨添加BA效果好。可能此濃度范圍對不定芽的分化作用影響不大。

筆者認為BA是誘導西瓜子葉分化不定芽必不可少的因素。而IAA、NAA以及AgNO₃可能參與西瓜子葉的分化，但不是調控西瓜子葉分化的關鍵因素。

3．4 抗生素質量濃度的篩選

抗生素濃度的確定，既要有效抑制非轉化細胞的生長，又能讓轉化細胞正常生長，所以在植物遺傳轉化過程中，對受體材料進行抗生素敏感性測定十分必要。本試驗所選用的Kan質量濃度與王慧中掣刪選用的相同，而與有些研究者使用的不相同，說明轉化西瓜品種對抗生素的敏感性不完全相同，而且不同研究者在合適抗生素濃度的選擇時會有不同的考慮，通常易于轉化的材料選擇較高的濃度，以減少假陽性植株，而難于轉化的材料則選擇相對較低的濃度，以增加獲得陽性植株的幾率。

3．5預培養對抗性芽再分化的影響

預培養對西瓜子葉不定芽的分化影響較大，本實驗發現外植體經過2～3 d時間的預培養能夠使外植體很好生長，提高抗性芽的分化率。這與張志忠等、Park等研究結論相似，而Choi等、牛勝鳥等分別研究發現預培養5、7 d后，抗性芽的分化率最高。秦新民等認為轉化只發生在細胞分裂的一個較短時期，即細胞只有處于分裂周期的S期，才具有外源基因的轉化能力。植物細胞具有分裂能力是轉化的根本。而西瓜外植體細胞最佳的分裂狀態并沒有研究得出統一結論。這一點有必要進一步研究。

4 結論

西瓜品種ZKM種子在質量分數0.6％瓊脂培養基上最適宜萌發。當子葉由黃色變為綠色，苗齡為5 d的無菌苗最適宜作為外植體，MS+BA 2.0 mg／L是最佳的誘導培養基。75 mg／L Kan是篩選抗性芽的最適質量濃度。外植體預培養2～3 d，與D_600nm值為0.4的農桿菌菌液共浸染10 min有利于西瓜轉化效率的提高。經PCR檢測，表明ZYMVcp基因已經導入西瓜植株，轉化頻率為0.15％。