干細胞技術在運動醫學領域中的應用

摘 要：回顧了干細胞技術的發展并綜述了干細胞技術在運動醫學中的應用，探討了干細胞技術在運動醫學領域有潛在的應用價值，結論表明，干細胞技術在半月板損傷、心肌缺血、肌腱損傷等方面都有應用價值，但具體技術手段還需進一步研究。

關鍵詞：干細胞技術；肌腱，運動損傷；半月板

中圖分類號：G804.5 文章編號：1009－783X(2007)06－0066－04 文獻標識碼：A

作者簡介：趙永才(1980-)，男，陜西謂南人，助教，研究方向為運動生物化學。

干細胞(stem cell)是一類具有自我更新與增殖分化能力的細胞。它具有再生為各種組織、器官的潛能，醫學界稱為“萬用細胞”，干細胞可分為3種類型：全能性干細胞(totlp－otent stem cell)，它具有分化為完整個體的潛能，如胚胎干細胞；多能性干細胞(monopotential stem cell)，這種干細胞只具有分化出多種組織細胞的潛能；單能干細胞(unipotentstem ceil)，也稱定向或專能干細胞，這類干細胞只具有分化形成某一種類型細胞的能力，多能性干細胞和單能干細胞又稱成體干細胞。

1 干細胞特性及研究方法

1.l 干細胞特性

既具有自我更新能力(self-renewal)，又具有多向分化潛能(muhilineage differentiation)是干細胞最顯著的生物學特性。干細胞可連續分裂幾代，也可以在較長時間內處于靜止狀態，干細胞本身不是終末分化細胞，而是未分化的原始細胞。干細胞分裂產生的子細胞或保持親代特征，仍作為干細胞，或不可逆地向終末分化。“可塑性”是近年來發現的又一重要特性，這一特性的發現不僅打破了組織再生來源于該組織干細胞的傳統觀念，而且具有重要的實用價值。利用干細胞的慢周期性和自我更新能力兩個特征，鑒定在體與離體干細胞是過去普遍采用的鑒別干細胞的最基本實驗手段，但這兩種方法應用時具有一定的局限性。目前研究人員多利用基因工程技術結合熒光素技術來鑒別干細胞，這種新技術的重要性在于允許人們檢測分化或定向分化時的干細胞，利用這種方法可以進行早期的干細胞分離，在組織中識別出或在分化過程中追蹤干細胞。

干細胞的分化、生長與保存均需要一定的細胞因子輔助，與干細胞相關的細胞因子可分為分化抑制因子和生長因子兩大類：分化抑制因子包括白血病抑制因子(LIF)等；生長因子則包括干細胞因子(SCF)、胰島素樣生長因子－1(IGF-1)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等。

1.2 干細胞的研究方法

干細胞技術的基本原理是利用干細胞的可塑性，胚胎干細胞是最原始的細胞，其在飼養層上含有分化抑制因子的培養基中培養時能保持未分化狀態，但在適當條件下可被誘導分化。在被注入受體胚胎時，能參與各種組織器官發育。正是由于這些特征，胚胎干細胞具有分化為一切細胞的潛能。多能干細胞和專能干細胞也具有分化為相應細胞的能力。要獲得所需的各級細胞，首先是干細胞的分離、獲取，然后在適宜的條件下進行培養以誘導分化為目的細胞。

分離干細胞，首先要獲得組織單細胞懸液，而關鍵一步就是得到純化的干細胞，目前有關純化干細胞的技術方法較多，主要方法如下。

方法一；選擇性培養基篩選法，在細胞培養條件下摸索適合的培養條件和調控因子，分選保持自身生物學特性的千細胞，實現體外擴增，是干細胞純化培養的常用方法之一。干細胞的體外篩選培養，以無血清的DMEM／F12(1：1)為基礎培養基，加入堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)或B227，培養在5％C02、37℃恒溫培養箱中。DMEM含有較高濃度的營養物質，有利于細胞分裂增生，F12則富含維生素和微量元素，有利于細胞分化。EGF和bFGF是有絲分裂原，對干細胞的增生起重要作用，最后通過其它途徑去除雜質得到純化的干細胞。

方法二：流式細胞分選法，這也是一種有效的分離、純化干細胞的方法，但流式細胞分選法存在的問題就是獲得的干細胞效率較低，而且獲得的千細胞受到的損傷較大，往往不能滿足研究需要，1990年Mihenyi等建立了磁性細胞分離系統(MACS)，這一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反應原性的抗體，直接與靶細胞的抗原分子或間接與事先結合在靶細胞表面的抗體進行反應，在細胞表面形成玫瑰花結，這些結合了磁珠的細胞一旦被置于強大的磁場下，就會與其他未被結合的細胞分群，具超強順磁性的磁珠脫離現場后立即消失磁性，這樣就可以提取或去除所標記的細胞，從而達到陽性或陰性選擇細胞的目的。

方法三：差速離心法，神經干細胞的分離多用差速離心法。對于骨髓神經干細胞的分離，通常抽取骨髓組織，用肝素抗凝，梯度離心后取中間細胞層，并沖洗去除紅細胞。對于臍血神經干細胞的分離，首先無菌條件下獲得新鮮臍帶血，其余步驟同骨髓組織的處理。分離骨髓間質干細胞(MSC)最常用的方法是將骨髓細胞進行密度梯度離心分離，收集低密度細胞層接種于MSC標準培養液中，5－7d后觀察到有梭形細胞粘附于塑料培養板表面，這就是MSC，通過換液除去未貼壁細胞后進行傳代培養，接近融合的細胞可用胰酶消化。在成體干細胞的保存方面，王桂葉等報道了－80℃冷凍保存人體外周造血干細胞技術，冷凍保護劑為CP－l(其主要成份為DMSO和羥乙基淀粉HES)。DMSO使溶液粘度增加，冷凍過程延緩，確保細胞有充足時間適應降溫變化，以減少損傷。

2 干細胞技術在運動醫學領域中的研究展望

2.1 干細胞技術在治療肌腱，骨骼等運動損傷中的應用

目前在肌腱，骨骼損傷治療方面也引入了干細胞技術，在這方面應用最多的就是間質干細胞(MSC)。骨髓間質干細胞可以大量獲得，應用最多，MSC的標志性表面抗原CD44經鑒定為陽性。在含有轉化生長因子一日(TGF-B)無血清培養液中，采用離心沉淀式培養法可以刺激骨髓MSC向軟骨細胞分化，研究發現通過離心讓細胞聚集成團是誘導MSC向軟骨細胞分化的條件，地塞米松也能誘導MSC向軟骨細胞分化，但效果不如TGF-B顯著。

有關人和動物的肌腱治療報道較多，龍劍虹等觀察兔骨髓間質干細胞(MSC)修復肌腱缺損的效果。分離培養家兔MSC，家兔分為實驗組和對照組，在兔跟腱處造成3era長的缺損，實驗組家兔以自體MSC為種子細胞、以膠原2聚羥基乙酸(PGA)為生物支架構建肌腱并移植于跟腱缺損處，對照組家兔僅以PGA生物支架修復跟腱缺損。于術后4、8、12周對移植部位進行組織學觀察。發現MSC培養11 d時CD44 mRNA顯示陽性，實驗組術后8周肉眼可見移植處有腱樣組織，12周時組織學觀察可見形態一致、順應力學方向排列于膠原中的腱樣細胞。對照組無這種現象，研究還發現由于骨形態發生蛋白(BMPl2)基因有誘導MSC成腱的作用Da]，將帶有BMPl2基因的質粒載體注射到肌腱或腱鞘處可以促進肌腱再生并減少組織粘連，路艷蒙等利用組織工程學的方法，以人發角蛋白人工腱(HHK)作載體，將轉有BMPl2的MSC種植其上，植入肌腱損傷部位，實驗發現植入部位產生新生肌腱，膠原纖維的排列整齊，被標記細胞具有腱細胞形態，實驗結果表明BMPl2基因對人MSC向腱細胞分化有誘導作用，轉有該基因的人MSC與HHK人工腱聯合植入更易于誘導機體肌腱的形成，具有良好應用前景，干細胞技術修復肌腱需要尋找最佳種子細胞和載體，以便于干細胞在接近生理環境的情況下發育生長。

骨髓間質干細胞(MSC)在骨科治療中必須要有相應的細胞外基質／支架，還要有豐富的血液供應，骨髓中MSC含量極少，將其在體外大量擴增后再用于治療就成為一種理想的方法，1998年Bruder利用培養擴增的MSC結合多孔生物陶瓷移植，成功地修復了狗股骨節段性缺損。Gronthos等把人MSC分離體外擴增后與羥基磷灰石／磷酸三鈣載體復合，再植入裸鼠背部皮下，發現載體周圍有骨髓和新骨組織形成，而且通過原位雜交顯示新骨組織中的骨細胞是人源的，證明MsC擴增后再植入是可行的。長期以來關節軟骨缺損治療一直是臨床上的難題，在成年人缺損后自然修復的軟骨組織為纖維軟骨而非功能性的透明軟骨。其在組織學、生物力學等特性方面都很缺乏。其原因主要是由于軟骨細胞幾乎沒有遷移能力，不能迅速聚集到創傷部位所致，因而幾乎可以認為軟骨的內在修復能力極弱甚至不存在，干細胞技術為軟骨缺損修復開辟了全新的途徑。An—gele等將兔骨髓MSC與人工材料復合后植入裸鼠的皮下和背部肌肉內，3周后發現植入體內有骨／軟骨組織形成，如果MSC在體外培養時接受了TGF-B的處理，則植人體內骨／軟骨組織的量將增加。Wakitani等人發現培養的MSC被植入兔股骨遠端內側髁大片的軟骨／骨缺損處一段時間后，這些MSC都變成軟骨細胞，重新覆蓋了髁的表面，同時位于缺損骨性基底的細胞也形成軟骨細胞，隨后快速沿著軟骨形成譜系的進程發展而成為肥大軟骨細胞。

競技體育中存在大量傷病，主要就是肌腱，骨骼損傷，很多傷病難以根治，反復發作，嚴重影響到運動員的競技狀態。干細胞技術可以應用到這方面，如在肌腱韌帶的治療中，原則上可以完全根治，并且無任何負作用，目前要解決的是干細胞在運動員損傷治療的時間周期的問題，干細胞技術的周期較長。還有一點就是要找到適合于人體，尤其運動員的干細胞支持骨架材料。

2.2 干細胞技術在半月板損傷治療中的作用

運動損傷中。半月板損傷很多，由于半月板所處的特殊部位，其在運動中承受壓力較大，損傷情況多種多樣，治療方法也不同，一般的損傷多用保守療法，嚴重受傷多用手術治療，包括開放式全切除，部分切除；關節鏡部分切除、縫合、異體移植等。

半月板損傷如果損傷到血液供應區，是縱形裂傷，經過關節鏡縫合可以痊愈，而目前醫務工作者關注的是無血供應區的損傷，盡管部分切除后半月板能獲得再生，但生物功能與原來相比承受負荷能力降低，還容易引發關節炎，干細胞技術可以彌補這些不足之處，將種子細胞播種于生物材料支架結構并移植入關節腔內，細胞在支架結構中逐步分化為纖維軟骨細胞，完成半月板的再生，稱為體內法Eal]，將干細胞種于生物材料制成的支架結構后，在體外條件下培養一定的時間，使播種細胞分化為纖維軟骨細胞，在其具備了半月板的理化特性后再回植入關節腔內，稱為體外。徐青鐳等以膠原一糖胺聚糖(GAG)模板為載體，將經體外擴增及細胞因子刺激后已進入軟骨細胞分化譜系的間充質干細胞回植人體內，結果術后3、6、12、24周組織學電鏡觀察顯示膠原一GAG模板逐漸被降解吸收，而MSC可逐漸合成分泌新生膠原，經不斷改建最終形成半月板樣纖維軟骨組織，而膠原對照組及空白對照組則僅見纖維組織樣的修復組織，吳海山等將已分離并經體外傳代培養擴增的兔骨髓間充質干細胞(MCS)在用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和轉化生長因子(TGF-B1)協同刺激后，用RT-PCR的方法從分子水平尋找進入軟骨細胞分化譜系的證據，兔骨髓MCS在用bFGF和TGF-BI協同刺激后，用PCR的方法探明有PC-I的編碼基因表達，證明其已經進入軟骨細胞分化譜系，結論證實bFGF和了GF-B1能夠刺激MCS的體外增殖并且使其進入軟骨細胞分化譜系，為半月板組織工程重建提供了可靠的自體來源種子細胞。

目前認為干細胞分化為半月板軟骨的途徑如下：將載有MCS的膠原一GAG模板回植入關節腔后，一方面，膠原模板在新生血管帶來的吞噬細胞和吞噬型滑膜細胞的作用下，逐漸降解；另一方面，新生血管帶來的各種趨化因子對MCS形成各種刺激，使其逐漸向纖維軟骨細胞分化，合成分泌I型膠原，起初膠原排列雜亂，后來在局部關節活動的力學刺激下，MCS合成的I型膠原經改建逐漸形成順應力學環境的有規則排列，在術后4到6周，外來膠原逐步降解，形成類似正常半月板結構。

2.3 干細胞技術在心肌缺血損傷中的應用

心肌缺血性病，如心肌梗死(myocardial infarction，MI)等一直是臨床治療的難點。心肌缺血引起心肌細胞壞死、凋亡造成心肌數目減少，心室重構促使心力衰竭發生，通常認為心肌細胞是終末分化細胞，缺乏增殖分化能力，成熟細胞不再發生有絲分裂，損傷后不能再生，只能由成纖維細胞填充，最終為瘢痕組織替代，并逐步發生心室重構，形成慢性心力衰竭。近年來探討干細胞移植改善缺血心肌功能，重建心肌細胞成為該領域的一熱門課題。骨髓間質干細胞在這方面的應用最多，因其具有來源充足、細胞培養成活率高和骨髓穿刺操作簡單安全及無免疫排斥等優點，已為國內外眾多研究者所關注。

Tomita等12‘’將來源于大鼠骨髓的間質干細胞體外培養傳代并經5－髓氮雜胞苷(5－髓aza)誘導分化后注入凍傷的MI模型中，移植細胞表達了心肌細胞特有的肌鈣蛋白I和肌球蛋白重鏈，移植組大鼠心肌瘢痕組織面積較對照組小，新生血管數量及直徑均較對照組明顯增加，左室收縮壓和左室收縮壓上升速率較對照組高，心臟功能得到改善。Makino等人在體外用5－aza處理從小鼠股骨中獲得的骨髓間質細胞，結果大約30％的骨髓細胞分化為類心肌細胞，表現為成纖維細胞樣的形態和特征，Orlic等的研究發現，將骨髓間質干細胞移植到鼠的心肌梗死部位后，不僅分化出了心肌細胞，表達了心肌增強因子－2(MEF-2)、心肌特異性轉錄因子－4(GA7A-4)等，另外還形成了冠狀血管的內皮細胞以及光滑肌細胞，在分化的心肌細胞胞質及緊密相連的細胞表面表達連接蛋白－43，從而修復了MI造成的心肌損傷。2001年Strauer等第一次將骨髓間質干細胞應用于，臨床，通過經皮冠狀動脈導管術將自體骨髓間質子細胞注入男性患者的冠狀動脈堵塞MI的梗死區，10周后計算機體層顯像術及放射性核素心室造影檢測顯示，梗死面積由24.16％減小至15.17%射血分數、心排血量較治療前提高20％-30%，左室舒張末容積減少30%，首次證明骨髓間質干細胞應用于臨床治療是安全、有效的，并可望成為一種嚴重MI的輔助治療措施。最近干細胞治療心肌缺血損傷又有新突破，骨髓起源的干細胞可以在生理或病理情況下可能被“征募”到循環中參與遠處多種組織的再生，但是其有很強的環境依賴性。但這種“自發”的“調動”作用較弱。應用骨髓干細胞動員劑將骨髓干細胞“驅趕”到外周血中，從而使外周血干細胞達到治療數量，利用干細胞“自發”地向損傷組織“回歸”，并在特定的組織微環境作用下分化為受損組織細胞，達到修復缺血損傷的作用。

運動領域中大負荷的運動經常導致心肌缺血，線粒體腫脹，嵴斷裂，進而肌絲紊亂，最終導致肌絲斷裂，解聚變性等現象。長期的反復大強度運動對心臟心肌細胞產生負面影響，容易引發心肌凋亡，盡管目前干細胞技術在這方面應用主要圍繞心臟病病人康復治療這一領域，但在運動醫學領域有其潛在的價值，由運動導致的心肌缺血、凋亡完全可以用干細胞技術治療，最近的研究結果可以給我們提示，干細胞可以在動員劑作用下遷移到心臟壞死部位并參與心機重建，那么這種動員劑是何物，能否鑒定?將有關能驅動自身干細胞到心肌部位的這種動員劑給參與健身鍛煉人群，或參與某些特殊的大負荷運動項目的運動員服用，那么是否可以預防心肌凋亡?或很輕松地治療心肌缺血?

3 總結

干細胞技術的發展給人類帶來福音，對運動性損傷，如脊髓損傷、肌肉韌帶拉傷、心肌缺血損傷、骨及軟骨、肌腱與韌帶損傷等具有潛在的應用治療價值。但目前干細胞技術還有不成熟的一面，到底是體外增殖干細胞再移植到缺損的人體部位還是先找到干細胞生長載體與附著的干細胞一起移植到體內更好還沒有研究過，有時還存在一定水平的免疫排斥反應，體育領域的應用到目前還未有報道，有待進一步研究。

1)干細胞技術是近年來迅速發展起來的一門學科，在醫學領域已經得到深入的研究，并且在臨床醫療方面得到廣泛的應用，但還存在較多問題。

2)干細胞技術可以應用在運動醫學領域，骨髓間質干細胞可以修復骨組織和肌腱。韌帶等，免疫排斥反應小，但治療周期長，還存在費用較高，尋找適合人體的干細胞載體骨架難等問題。

3)干細胞技術可以治療半月板的損傷，可以解決半月板缺血區損傷帶來的問題，既可以修復再生組織，又能使半月板保持原來的生物功能。

4)干細胞技術也可以治療心肌缺血引發的細胞凋亡，保護心臟功能。