益氣活血方對急性心肌缺血大鼠模型ＭＭＰ－９及ＴＩＭＰ－１表達(dá)的影響

摘要：目的 觀察益氣活血方對急性心肌缺血大鼠模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMIP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶特異陸抑制物-1(TIMP-1)表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用結(jié)扎冠狀動脈左前降支方法建立Wistar大鼠急性心肌缺血模型，運(yùn)用HE染色觀察其病理改變，同時以ELISA法和SP免疫組化法檢測血清TIMP-1含量及心肌組織中MMP-9的陽性表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠出現(xiàn)顯著的心肌缺血損傷的病理形態(tài)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組均可增加心肌缺血后大鼠血清TIMP-1含量(P＜0.05)，中藥高劑量組血清FIMP-1含量顯著高于低劑量組和陽性對照組(p＜0.01)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠心組織織中MMP-9表達(dá)較有明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論 益氣活血方對大鼠缺血心肌有顯著的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與影響TIMP-l及MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：益氣活血方；急性心肌缺血；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物-1

中圖分類號：R542.2 R289.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1216-03

急性心肌梗死(AMI)是嚴(yán)重危害人類健康的因素之一，其病理改變涉及諸多因素。目前大量研究已證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶族(mamx metauoprotelnase，MMPs)及其特異性抑制物(TIMPs)在AMI的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。本實(shí)驗通過建立Wistar大鼠急性心肌缺血模型，來研究中藥益氣活血方對基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶特異性抑制物-1(tISSUC inhibltor OF matrix metallloproteinase-l，TIMP-1)表達(dá)的影響，初步探時其作用機(jī)制，為尋求中醫(yī)藥治療AMI有效方法提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠100只，體重180g±10g，由北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)公司提供。

1．2 實(shí)驗藥品、試劑 ①益氣活血方由黃芪、黨參、五味子、川芎、赤芍、丹參等藥物組成。中藥經(jīng)水提取，制成浸膏，用時以蒸餾水稀釋，制成每毫升含4g生藥的懸液備用。②陽性對照藥：酒石酸美托洛爾，配成0.46mg/mL溶液。由阿斯利康制藥有限公司提供，批號：0707012。③試劑盒：大鼠TIMP-1定量EI，ISA試劑盒購自于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；兔抗鼠MMP-9單抗、SP試劑盒及DAB顯色劑購自于北京中山生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1．3 動物模型制作與分組 100只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、陽性對照組，各20例。AMI模型建立方法如下：在肺動脈圓錐與左心耳交界處下(1～2)mm用無創(chuàng)手術(shù)線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，以結(jié)扎部位下心肌組織變白和體表心電圖肢體Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)，ST段弓背向上抬高，持續(xù)30 mtn以上作為模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組大鼠以只穿線不結(jié)扎。各組大鼠于造模后，治藥飼養(yǎng)7d，假手術(shù)組和模型組給予蒸餾水16g/(k8·d)；中藥高劑量組給予益氣活血方16g/(ks·d)；中藥低劑量組給予益氣活血方8g(kg·d)；陽性對照組給予酒石酸美托洛爾0.96mg/(kg·d)。以上劑量均按成人海日服用量換算。

1．4 檢測指標(biāo) 光鏡觀察心肌組織的病理改變，免疫組化檢測MMP-9，ELISA檢測TIMP-1含量。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對其進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料應(yīng)用t檢驗，兩兩比較應(yīng)用q檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)改變 模型組和各用藥組左冠狀動脈結(jié)扎后形成左室游離壁及心尖部的透壁性心肌梗死；模型組心肌組織HE染色顯示梗死區(qū)心肌纖維溶解斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)纖維化明顯；假手術(shù)組無心肌梗死發(fā)生，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列整齊，基本無炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化；各用藥組心肌組織表現(xiàn)出不同程度的心肌纖維排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化。

2．2 各組大鼠心肌組織MMP-9及血清了IMP-1檢測結(jié)果 在假手術(shù)組大鼠的心肌組織中MMP-9少見，陽性表達(dá)或不表達(dá)；模型組大鼠心肌組織中MMP-9表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.01)；各藥物干預(yù)組心肌組織中MMP-9的表達(dá)較模型組顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，各藥物千預(yù)組均叮增加AMI后大鼠血清了IMP-1含量(P＜0.05)，中藥高劑量組血清TIMP-1含量顯著高于低劑量組和陽性對照組(p＜0.01)。故可認(rèn)為益氣活血方及美托洛爾可增加AMI后大鼠血清丁IMP-1含量。同時，益氣活血方高劑量組中了IMP-1表達(dá)最高，效果明顯優(yōu)于西藥對照組。詳見表1。

3 討 論

急性心肌梗死屬于中醫(yī)學(xué)胸痹、真心痛范疇。近年來多數(shù)醫(yī)家達(dá)成共識，冠心病為本虛標(biāo)實(shí)之證，其中氣虛血瘀貫穿疾病的不同病理階段，因此，益氣活血法成為治療心肌梗死的主要治法之一。根據(jù)相關(guān)認(rèn)識，結(jié)合長期臨床經(jīng)驗擬定了益氣活血方，臨床上用于治療心肌梗死后氣虛血瘀證，全方由黃苠、黨參、五味子、川芎、赤芍、丹參等組成。長期臨床實(shí)踐證實(shí)，本方可以顯著緩解病人的臨床癥狀、改善心功能，進(jìn)而提高AMI后生活質(zhì)量。以往實(shí)驗研究證明益氣活血組方各藥物可以擴(kuò)張冠狀動脈、改善缺血區(qū)血液供應(yīng)、抑制血小板聚集、抗自由基損傷、逆轉(zhuǎn)心室重塑等。

基質(zhì)金屬蛋白酶是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白水解系統(tǒng)。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子是MMPs的特異性抑制因子、參與調(diào)節(jié)組織局部MMP8的活性。研究證實(shí)MMPs、TIMPs與心肌梗死后心室重構(gòu)有密切關(guān)系。心肌梗死后心室重構(gòu)可導(dǎo)致嚴(yán)重心室擴(kuò)張、功能障礙以及致殘和死亡。細(xì)胞外基質(zhì)的改建是心室重構(gòu)重要的分子機(jī)制，近年的研究表明，MgPs及TIMPs能持續(xù)降解間質(zhì)的纖維類膠原，在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中具有重要作用，參與多種生理及病理損傷過程。

MMPs是一類含鋅的內(nèi)源性蛋白酶，分為24個亞型，本研究中所檢測的MMP一9屬于明膠酶，在某些因素作用下(如RAS系統(tǒng)、TNF-α等)，MMP-9活性增加，促進(jìn)膠原降解。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死后1周，模型組較假手術(shù)組心肌內(nèi)MMP-9表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。由于MMP-9升高，降解膠原，促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生。用中藥益氣活血方1周后的心肌梗死大鼠，梗死區(qū)MMP-9表達(dá)較模型組明顯減弱，左室游離壁及心尖部損傷程度明顯減輕，梗死區(qū)室壁厚度也高于模型組，說明它可能通過抑制梗死區(qū)MMP-9而抑制急性期梗死區(qū)膠原降解過程，從而有助于減輕或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的發(fā)生。

TIMPs家族是一個多基因家族的編碼蛋白。在脊椎動物中已證實(shí)的TIMPs有4種(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和T1MP-4)，它們的表達(dá)在發(fā)育和組織重構(gòu)中受調(diào)控。通常TIMPs以1:1的克分子比例與激活的MMPs形成高親和力復(fù)合物并通過封閉IvLMPs的催化區(qū)從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解。T1MP-1能夠有效地抑制MMP-9等大多數(shù)MMPs，對MMPs的表達(dá)起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，因此，有人認(rèn)為是預(yù)測心血管事件的獨(dú)立因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益氣活血方及美托洛爾可增加AMI后大鼠血清TIMP-1含量。同時，益氣活血方高劑量組中丁IMP-1表達(dá)最高，說明其改善AMI后心肌纖維化的效果明顯優(yōu)于西藥對照組。

AMI后基質(zhì)生成細(xì)胞的增生以及膠原合成與降解之間的平衡決定了心肌組織纖維化的程度。而梗死后MMt)s被各種因素激活，引起膠原溶解活性的變化，這種活性被TIMPs限制局限于損傷部位。TIMPs合成受激活的MMPs水平調(diào)節(jié)，因此膠原的降解反映MMPs和TIMPs的不平衡。降解細(xì)胞外基質(zhì)的MMPs和抑制MMPs的內(nèi)源性TIMPs的良好平衡在維持正常的重構(gòu)和功能中起重要作用，不平衡如MMPs增加或TIMPs減少，或高M(jìn)MPs/TIMP比，不利于重構(gòu)。本研究表明，MMP-9的表達(dá)和活性的增強(qiáng)，以及TIMP-1抑制作用的減弱在梗死后細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)過程中具有重要作用，是AMI進(jìn)展的推動力量之一。中藥益氣活血方對TIMP-1促生作用以及對MMP-9的表達(dá)活性的抑制可能是益氣活血法治療AMl的作用機(jī)制之一。

作者簡介：宋希新(1960—)，男，畢業(yè)于長春中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)工作于吉林省吉安市中醫(yī)醫(yī)院(郵編：134200)；李杰，工作于吉林省吉安市中醫(yī)醫(yī)院。

(本文編輯 郭懷印)