重組腺病毒表達ＩＬ－６基因對大鼠缺血的保護作用

摘要：目的 構建攜帶白細胞介素－6(IL-6)基因的腺病毒載體Ad－IL6，在大鼠腦缺血模型中觀察外源基因IL-6的表達對腦缺血損傷的影響。方法 RT-PCR擴增人IL-6cDNA序列，構建攜帶IL-6基因的腺病毒載體，在293細胞中重組腺病毒Ad-IL6；通過夾閉雙側頸總動脈合并低血壓以減少腦血流量，制備急性腦缺血大鼠模型；分別在術前、術后尾靜脈注射Ad-IL6，觀察大鼠神經癥狀，進行神經功能評分和腦組織病理觀察。結果 以健康成年人血液單個核細胞成功擴增出IL-6 cDNA序列，并在293細胞中重組出腺病毒Ad-IL6；以1×10⁹pfu/200μL的病毒劑量治療，術前治療組、術后治療組和手術無治療組大鼠的神經癥狀評分較假手術組高，腦組織出現病理損傷；術前治療組大鼠的神經癥狀評分較術后治療組和手術無治療組低，腦組織病理損傷輕；而術后治療組評分略高于手術無治療組，但無統計學意義。結論 IL-6對中樞神經系統具有神經毒性及神經營養、神經保護雙重作用。損傷前IL-6的正?；蚋咚奖磉_狀態對隨后的神經損傷可起到一定保護作用，但在體內神經損傷激活了免疫反應后增加IL-6的表達，則起到加重損傷的負面效應。

關鍵詞：白細胞介素-6；腺病毒；神經損傷；神經保護；大鼠

中圖分類號：R743 R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-1349(2007)12-1214-03

白細胞介素－6(interleukin－6，IL－6)是由巨噬細胞、單核細胞、T細胞、B細胞等多種細胞分泌的一種多肽物質，具有廣泛的生物活性，可作用于多種靶細胞，除參與機體的炎癥反應和抗感染防御機制外，還與自身免疫疾病密切相關。研究表明，IL-6在腦血管病的發病過程中起重要作用。國外通過轉基因小鼠腦內過度表達IL-6的實驗，發現IL-6可引起神經元的退行性變，從而導致嚴重的神經性疾病。但也有實驗證明，IL-6可通過刺激星形膠質細胞的活化增殖及合成神經營養因子而發揮神經保護功能，其本身也具有神經營養因子的類似作用，可誘導神經細胞分化生長，發揮促神經修復作用。鑒于IL-6在中樞神經系統缺血損傷過程中的作用尚未完全闡明，還存在著互相矛盾的結果，有必要進行更深入的研究。本項研究克隆IL-6基因，構建攜帶IL-6基因的腺病毒載體Ad-116，同時建立急性腦缺血損傷大鼠動物模型，在大鼠腦缺血損傷發生的前后，給予Ad-IL6灌注，繼而觀察外源基因IL-6的表達對腦缺血損傷轉歸和預后的影響。力求闡明IL-6在心腦血管疾病的作用和意義。

1 材料與方法

1．1 材料來源 腺病毒載體質粒購自Microbix Biosystem公司，內切酶購自NEB公司，293細胞系來源于中科院上海細胞所，Wistar大鼠來源于中科院上海動物所，Ltipo Factamine2000轉染試劑盒、Trizol試劑盒、一步法反轉永POR試劑盒為LifeTechnologies產品。引物由上海申能博彩生物公司合成。

1．2 攜帶IL－6的腺病毒載體的構建 根據GeneBankBC015511的基因序列，合成IL－6 cDNA引物，由上海博彩生物公司合成。上游引物：5’－cgg aat tcg CCC agc tat gaa ctc ctt ctcCaC-3'，下游引物：5’-gcg teg act gec ot get aca tn gcc gaa gag-3’。上下游引物引入EcoRI和SalI位點。

取健康成年人血6 mL，分離單個核細胞，采用TrlxD試劑提取總RNA。以總1LNA2μg為模板，RT-PCR擴增人IL-6cDNA序列，擴增片段大小671bp?；厥諗U增產物，EcoRI+San酶切后，插入T載體，送上海申能博彩生物公司測序。

經測序證實后，EcoRI+SalI酶切T載體，回收661bp的酶切片段，插入到腺病毒載體pDC315中，經酶切和PCR鑒定正確后，與pBHGIoxddEl3ere一同轉染293細胞，具體方法參見轉染試劑盒操作說明書。共轉染后12 d出現病毒空斑，經過空斑純化，得到重組腺病毒Ad-IL6。采用IL-6 cDNA特異性引物進行腺病毒的鑒定。

1．3 構建動物模型 參考文獻[6]方法制備大鼠腦缺血模型。雄性Wistar大鼠20只，體重300g±50g，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.75g/kg)。取仰臥位，無菌條件下分離兩側頸總動脈并分別置線備用。麻醉術中及術后清醒前，用烤燈維持動物體溫在37.0℃±0.5℃。實驗分4組，術前治療組、術后治療組、手術無治療組和假手術組，每組5只。術前治療組、術后治療組和手術無治療組，用動脈夾通過夾閉雙側頸總動脈60 min合并低血壓以減少腦血流量，造成急性腦缺血。假手術組只進行兩側頸總動脈分離并分別置線，而不做動脈夾閉。

1．4 動物模型治療及觀察 術前治療組和術后治療組大鼠分別在手術前3h和手術后1h時進行重組腺病毒Ad－IL6注射，采用尾靜脈注射，每只給予1×10⁹pfu/200μL的病毒劑量。術后24h內每6h觀察記錄1次大鼠神經癥狀，按0分～4分標準評分，記錄分值。

1．5 腦組織病理觀察 術后24h將大鼠斷頭取腦，10％中性甲醛溶液固定腦組織12h，常規石蠟包埋切片，HE染色觀察腦組織病理形態的改變。

1．6 統計學處理 采用方差分析進行統計學分析。

2 結 果

2．1 重組腺病毒的鑒定 采用IL-6 cDNA特異性引物，對重組腺病毒Ad-II，6進行PCR鑒定，擴增出IL-6 cDNA序列，擴增片段大小671bp。證實腺病毒Ad-IL6重組成功。詳見圖1。

2．2 動物模型評分 實驗中20只大鼠成功制作模型18只，術前治療組和術后治療組各有1只大鼠在手術中死亡。術前治療組、術后治療組和手術無治療組大鼠的神經癥狀評分較假手術組高(P＜0.001)，顯示大鼠腦缺血模型建立成功；術前治療組大鼠的神經癥狀評分較術后治療組和手術無治療組低(P＜0.05)，顯示術前IL-6表達發揮神經保護作用；而術后治療組評分略高于手術無治療組，但差異無統計學意義，顯示術后增加IL-6表達有可能加重神經損傷。每組中各時間點之間比較，經過手術的腦缺血模型組大鼠的神經癥狀評分，有隨時間進展而增高的趨勢，在18h，24h的評分高于6h的評分(P＜0.05)，而假手術組則在各個時間點的評分沒有差別。詳見表1。

2．3 腦組織病理改變 假手術組大鼠的腦組織神經細胞胞膜清晰完整，無變形、水腫，核仁清晰可見。而其他組的大鼠腦組織病變區域呈現不同程度的間質疏松、神經細胞腫脹明顯、間質水腫，細胞及血管周圍間隙增大，術前治療組略輕，術后治療組和手術無治療組更為明顯。

3 討 論

已有的免疫學研究表明，IL-6等白細胞介素是促進多種急性炎癥反應、免疫反應的炎癥介質或是免疫調節因子。包括急性腦血管病在內的各種疾病的發病過程，都可以檢測到細胞因子IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)等的含量明顯升高。但對這些細胞因子含量變化的生物學意義，還存在爭論，特別是IL-6在中樞神經系統缺血損傷過程中的作用機制尚未完全闡明。

IL-6等炎癥介質加重腦組織損傷的機制，可能是多方面的。如可促使中性粒細胞釋放活性氧和彈性蛋白酶，對血管內皮細胞和神經細胞造成直接的損傷，加重腦組織水腫及神經細胞的壞死或凋亡；促進血小板激活因子、凝血因子Ⅷ等多種組織因子的釋放；促進凝血過程及血管舒縮功能紊亂，引發血栓發生；增加自由基等神經毒性物質的產生和釋放。但是也有學者對此有不同看法，認為IL-6是一種腦缺血后神經細胞死亡的內生拮抗劑，可起到神經保護作用。有實驗證明，IL-6具有神經營養因子的類似作用，可誘導神經細胞分化生長，發揮促神經修復作用。研究發現，急性腦梗死血清IL-6表達水平升高的病人，臨床療效明顯優于IL-6水平低的病人，提示IL-6在急性腦梗死病人腦損傷修復過程中起神經保護及神經營養作用。

本項研究表明，IL-6發揮神經損傷作用還是神經保護作用，與其本身表達的時相有很大關系。術前治療組大鼠的神經癥狀評分較術后治療組和手術無治療組低，并且該組的病理切片顯示腦組織水腫也比術后治療組和手術無治療組輕微，說明在術前給予外源性IL-6基因并誘導其表達，具有明顯的神經損傷保護作用。術后治療組評分略高于手術無治療組，顯示術后給予外源性IL-6表達不但沒有神經保護作用，而且有可能加重神經損傷。缺血大鼠模型的神經損傷在24h內有隨時間進展而加重的趨勢。實驗表明，IL-6對中樞神經系統具有神經毒性及神經營養、神經保護雙重作用。損傷前IL-6的正常或高水平表達狀態對隨后的神經損傷可起到一定保護作用，但在神經損傷發生后，體內激活了免疫反應，此時增加IL-6的表達，則起到加重損傷的負面效應。因此，進一步研究IL-6作用機制，并通過各種方法使他們發揮神經元保護作用而拮抗其促炎效應，可能是今后治療腦缺血的一條新的有效途徑。

作者簡介：巽筱倩(1967—)，女，畢業于徐州醫學院，副主任醫師。剮教授，現工作于江蘇省鹽城市第一人民醫院(郵編：224001)；蘇長青，工作于上海東方肝膽外科醫院。

(本文編輯 王雅沾)