５９５ｎｍ激光對兔耳瘢痕成纖維細胞增殖與凋亡的影響

[摘要]目的：探討595nmVbeam激光照射對增生性瘢痕動物模型傷口愈合過程中成纖維細胞增殖與凋亡的影響。方法：成年大耳白兔20只，建立兔耳腹側面增生性瘢痕模型，對比研究在瘢痕形成過程中595tlmVbeam激光照射對兔耳瘢痕成纖維細胞的影響，采用免覆組化方法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達和細胞凋亡的原位檢測。結果：兔耳增生性瘢痕經595nmVbeam激光照射后，按不同時間段取材進行免疫組化染色并與對照組比較，高倍鏡下觀察結果，顯示PCNA蛋白表達明顯減弱，細胞凋亡增加。結論：595nmVbeam激光照射可抑制兔耳增生性瘢痕成纖維細胞的增殖過程，誘導細胞凋亡。應用595nmVbeam激光預防和治療瘢痕是可行的。

[關鍵詞]vbeam激光；增生性瘢痕；成纖維細胞；免耳瘢痕模型；細胞凋亡

瘢痕形成是美容醫學臨床上的一個常見問題，是燒傷或手術等創傷后常見的并發癥，但目前沒有一種治療可以從根本上阻止瘢痕的發生或者獲得令人滿意的療效。Vbeam激光是一種波長為595nm的脈沖染料激光，近年來脈沖染料激光應用于臨床治療各種血管性病變的同時，發現其對瘢痕有一定作用。本實驗通過應用兔耳瘢痕模型為實驗對象，觀察595nmVbeam激光對增生性瘢痕成纖維細胞增殖和凋亡的影響，探討其對增生性瘢痕治療作用的機制，為應用于臨床預防和治療增生性瘢痕提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1．1 實驗動物：日本大耳白兔20只，雌雄不限，體重1.5～2.0kg，由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心提供。

1．2 主要試劑：Ⅰ抗鼠抗兔PCNA單克隆抗體、Ⅱ抗羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞凋亡原位檢測試劑盒購于羅氏公司。

1．3 主要儀器設備：595nm Vbeam激光血管治療儀(美國CANDELA公司生產)；OLYMPUS光學顯微鏡。

1．4 建立動物模型：將大耳白兔分籠飼養2天后，按文獻報道方法建立增生性瘢痕動物模型，即在3％戊巴比妥那麻醉下，用圓形鉆刀在每只兔耳腹側誣沿長軸避開血管，各做4個直徑6mm的圓形全層皮膚缺損創面，深達軟骨表面，每個創面間隔2cm以上，共做160個。術后常規抗感染，自由進食。術后21天，160個創面中有103個創面愈合突出于皮膚表面，即形成增生性瘢痕。

1．5 實驗分組：創面上皮化后切取一組增生性瘢痕8處(A組)，然后將形成的增生性瘢痕隨機分為兩組，分別為激光治療組和對照組。激光治療組在創面上皮化后開始進行激光照射，采用Vbeam激光血管治療儀，波長595nm，本組采用的治療參數是光斑直徑7mm，發射頻率1.5Hz，脈寬1.5～6ms，能量密度7～11J／cm，動態冷卻發射時間和間隔時間均為30ms。開始時每周照射一次，一個月后改為每兩周照射一次，共兩個月。對照組不進行治療。

1．6 標本取材及處理：在上皮化后1、2、4、6、8周分別切除兩組增生性瘢痕各8處(B，c，D，E，F組)，加上上皮化后切取的一組瘢痕，共計取材88處。各組組織均4％多聚甲醛固定48h后常規脫水，石蠟包埋，擬行PCNA蛋白測定和細胞凋亡的原位檢測。

1．7 觀察指標

1．7．1 PCNA蛋白測定：應用常規2步免疫組化法，按試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，細胞核內含有棕黃色顆粒者為陽性細胞。在400倍光鏡下觀察結果，每張切片找5個陽性細胞最多的視野進行計數，陽性細胞反應率(％)=陽性細胞數／細胞總數×100％，結果取均數。

1．7．2 細胞凋亡的原位檢測：采用TUNEL法，按步驟操作。細胞核內含有淡棕黃色至深棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細胞，即凋亡細胞。400倍光鏡下觀察結果，隨機選擇3個陽性細胞最多的高倍視野進行計數，死亡率以凋亡細胞／細胞總數×100％表示，結果取均數。

1．8 統計學分析：每組樣本數據用均數±標準差即(x±s)表示，采用SPSS軟件進行統計學處理，使用配對t檢驗，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

納入實驗大耳白兔20只，實驗中無脫落，均進入結果分析。

2．1 PCNA檢測：可見表皮基底細胞層，棘細胞層，顆粒層和大量真皮成纖維細胞及真皮血管內皮細胞較多增殖細胞核抗原陽性表達。上皮化后增殖細胞核抗原陽性細胞反應率為18.33％，以后隨時間推移逐漸增高，至上皮化后4周達高峰。從上皮化后1周開始可見激光治療組增殖細胞核抗原蛋白表達較對照組減弱，經統計學處理，兩組差異具有極顯著性(P＜0.01)，具體見表1。上皮化后4周，對照組增殖細胞核抗原表達，激光治療組增殖細胞核抗原表達減弱。

2．2 細胞凋亡原位檢測結果：在成纖維細胞和血管內皮中可見凋亡小體，即凋亡細胞。在瘢痕形成的早期，僅有少量陽性細胞，隨時間推移凋亡細胞逐漸增加，在上皮化4周時凋亡細胞較前明顯增多，真皮中見較多凋亡的成纖維細胞，而到了上皮化6周時才達到凋亡高峰，至上皮化8周時凋亡指數仍然持續很高。從上皮化后4周開始，兩組瘢痕凋亡率有極顯著性差異，P＜0.01，上皮化后6周時對照組凋亡細胞，激光治療組凋亡細胞增多。

3 討論

創傷修復過程中，由于全身和局部因素的影響，常可導致細胞外基質(ECM)過度沉積和膠原降解減少而形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩，病理表現為成纖維細胞的大量增殖和膠原的過度沉積。而且在不同的形成階段有著不同的臨床表現和發展趨勢，不僅嚴重影響外貌和功能，也會造成患者心理的異常。目前對于增生性瘢痕的治療方法很多，用于防治瘢痕的藥物研究也非常多，但人們對增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成的原因尚不完全明了，臨床療效還不盡如人意。

激光治療增生性瘢痕始于20世紀70年代后期。激光治療瘢痕的原理是利用激光的燒灼、氣化、切割、凝固及散焦等特有作用，去除瘢痕組織或損傷瘢痕內血管、抑制膠原合成和細胞增殖及誘導細胞凋亡。應用脈沖染料激光治療瘢痕始于20世紀90年代初期，原理在于其能特異作用于微血管。1994年Alster報道了應用585nm閃光燈泵浦染料激光治療靜止期紅斑性增生性瘢痕，經皮膚紋理分析和臨床觀察等研究證實1到2次治療就有明顯改善。Vbeam激光血管治療儀也是一種脈沖染料激光，波長為595nm，由于其波長更長，對組織的穿透也更深。其脈寬具有可調性，有1.5ms、6ms、lOms、20ms、30ms、40ms，可根據不同病變適當選擇，超長脈寬使組織有更長時間吸收激光能量，得到溫和加熱和均勻凝結，會取得更好的治療效果。另外該激光儀還配有動態冷卻系統，既能有效降低激光熱效應對皮膚的損害又能減輕病人的疼痛，在治療血管性疾病中起到良好效果。應用脈沖染料激光治療瘢痕的原理在于抑制小血管的形成并閉合小的血管，來加重瘢痕缺氧程度并減少生長因子及成纖維細胞來源，從而預防并治療瘢痕。由于增生性瘢痕早期含有大量毛細血管，微循環灌注過度，瘢痕外表呈鮮紅色。激光通過其光熱溶解作用，破壞組織細胞，使毛細血管叢凝固，組織缺血缺氧，乳酸代謝增加，pH值降低，顆粒細胞溶解后脫顆粒釋放膠原酶；血流減少后巨球蛋白含量下降，可間接增強膠原酶活性，膠原分解增加。另外激光的高熱溶解作用可使膠原骨架斷裂，促進膠原結構重建，瘢痕變軟，體積變小。

成纖維細胞增殖活性在增生性瘢痕的發生發展中起到重要作用。而其增殖活性又分為增殖分化功能和細胞外基質的合成分泌功能。增殖細胞核抗原PCNA是一種細胞周期調節蛋白，在DNA復制過程中起重要作用。PCNA的表達已證實與細胞的增殖狀態密切相關。細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是由基因控制的、細胞自主的、有序的死亡過程。細胞凋亡不僅參與正常創傷愈合的組織重建，而且在增生性瘢痕的形成、消退過程中亦扮演十分重要的角色。當某些原因導致增生性瘢痕組織中的細胞凋亡數減少，則阻礙增生性瘢痕成熟；相反，若通過某種物理的或化學的手段來誘導或促進瘢痕組織中的細胞凋亡，則加快增生性瘢痕的消退。脈沖染料激光對血管的作用已經得到證實，而其對成纖維細胞增殖與凋亡活性的作用還鮮有報道。因此本實驗用脈沖染料激光作用于兔耳增生性瘢痕，通過與對照組比較增殖細胞核抗原蛋白表達和細胞凋亡的變化來確定595nm Vbeam脈沖染料激光對兔耳增生性瘢痕形成過程的影響，證實其對增生性瘢痕的預防及治療作用。經免疫組化分析證實增殖細胞核抗原PCNA表達從上皮化后開始逐漸增加，至上皮化后4周達高峰。經595nm Vbeam脈沖染料激光照射后，激光治療組增殖細胞核抗原PCNA表達從上皮化后1周開始同對照組比較可見明顯減弱，提示成纖維細胞的增殖活性降低。TUNEL技術檢測細胞凋亡率顯示在兔耳傷口上皮化后僅有少量凋亡細胞，在上皮化后4周時凋亡細胞有所增加，而凋亡高峰在上皮化后6～8周才出現。經595nm Vbeam脈沖染料激光照射后，治療組在上皮化后4周起凋亡率與對照組比較就有明顯增加。本實驗結果顯示，在增生性瘢痕形成過程中應用Vbeam脈沖染料激光照射，可抑制成纖維細胞增殖活性，誘導細胞凋亡，減輕兔耳瘢痕增生程度，從而驗證了Vbeam激光照射對兔耳增生性瘢痕具有預防和治療作用。而且這種新型激光利用瞬間的高能量作用，既消除病變又不造成周圍組織的燒傷，還能使膠原纖維平順緊密，可以產生美容效果。但其對于人類增生性瘢痕的作用還有待于進一步的研究。