人脂肪間充質干細胞凍存方法的改進

[摘要]目的：探索理想的冷凍人脂肪間充質干細胞的方法。 方法：采用常規方法體外培養并擴增人脂肪間充質干細胞，消化細胞并洗滌離心加入10％二甲基亞砜、30％胎牛血清、60％MEM的細胞凍存體系，直接置-70℃冰箱貯存。凍存4、8和12周后，37℃水浴復溫，通過檢測細胞周期細胞表型和成脂的多向分化潛能，以鑒定該方法的可行性。結果：消化后不經過傳統的程序性降溫凍存技術，直接在-70℃冰箱贍存，其細胞生物學特性無明顯改變，細胞仍存在成脂的多向分化潛能。結論：人脂肪間充質干細胞懸液直接-70℃冰箱貯存不影響其生：物學特性，是冷凍保存的一種可行方法。

[關鍵詞]人脂肪間充質干細胞；分化；脂肪細胞；冷凍貯存

人脂肪間充質干細胞具有多向分化潛能，在一定的誘導條件下，可以分化為成骨、軟骨、脂肪等多種細胞，是組織工程，尤其是骨或軟骨組織損傷修復中重要的種子細胞。因此，對其體外分離培養、擴增及保存方法等研究具有重要的意義。人脂肪間充質干細胞分離培養周期較長，原代細胞鋪滿的時間約2周以上，達到實驗用的數量一般需要3劇左右。我們在工作中發現，人脂肪間充質干細胞體外長期培養傳代容易發生自發分化，失去其多向分化的潛能。為保證實驗的連續性，隨時提供大量的實驗或組織工稗用的種子細胞，建立～種行之有效的方法是必要的，通過檢測人脂肪間充質干細胞在凍存復蘇后的細胞周期，細胞表型和成脂的多向分化潛能來鑒定凍存方法的可靠性。

1 材料和方法

1．1 人脂肪間充質干細胞的分離純化及培養：脂肪組織來源于蘭州軍區蘭州總醫院美容中心行脂肪抽吸術的患者，身體健康。無菌條件下，在局部腫脹麻醉下采用注射器法抽取50ml脂肪組織，靜置半小時，去除上清液體，獲得純度較高的脂肪顆粒，用等容的D-Hank’s平衡鹽液清洗4次，去除細胞碎片。然后用150ml HBSS(含0.075％膠原酶I)，在37℃，振動消化1h。膠原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后離心1200r，10min。細胞被懸浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目篩網過濾。離心后，細胞懸浮在培養基中。加至培養瓶，37℃，C0孵箱中培養24h，未貼壁的細胞和殘渣被除掉，新鮮培養液加至貼壁細胞。細胞培養至80％融合時，用胰酶／EDTA消化和按1:1的比例傳代。

1．2 人脂肪間充質干細胞的冷凍保存及復蘇：取原代或擴增培養的人脂肪間充質干細胞的培養瓶吸棄培養體系，胰酶／EDTA消化，加PBS洗滌后加入現配的含10％DMSO、30％胎牛血清的MFM的凍存體系，按12ml／瓶將瓶底面積鋪滿，密封瓶口，用包裹兩層，平整存放于至-70℃低溫冰箱。存不同時間后，取出含細胞的培養瓶，放入水溫38℃～40℃的恒溫水浴箱快速解凍。此時操作應避免劇烈晃動，以免使細胞損傷，待冰塊基本融化后棄上清，用PBS洗滌2次，加入MEM的培養體系，37℃培養箱內培養。需要注意的是，細胞凍存體系必須配制后再加入細胞中，各種成分不能單獨加入，并且凍存的細胞盡可能短時間存放在液體狀態下的凍存體系中。

1．3 凍存前后人脂肪間充質干細胞表面標志的鑒定：培養的脂肪干細胞經過消化離心(1000r／min，5min)后細胞重懸；細胞計數后將細胞濃度調整為1×10／L，分別于人抗CD34、CD44、CD45、CE108、CD49d和HLA－DR單克隆抗體室溫反應30min，PBS洗滌2次后于FITC標記的二抗避光作用30min。用PBS重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測。

1．4 凍存前后人脂肪間充質干細胞細胞周期的測定：培養的脂肪干細胞經過消化離心(1000r／min，5min)，調整細胞濃度至1×10／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNaseA處理30min，PI染色10min。用Cellquest軟件獲取10000個細胞，ModiFit分析細胞周期。

1．5 人脂肪間充質干細胞多向分化的誘導：取凍存前后的人脂肪間充質干細胞，脂肪細胞的誘導：細胞以2×10細胞／孔接種于6孔培養板，其中含有1μmol／L的地塞米松、0.5mmol／L的甲基黃嘌呤異丁酯、100mmol，／L的消炎痛、10％的胎牛血清DMEM(試劑均為終濃度，SIGMA公刮產品)。

2 結果

2．1 人脂肪間充質干細胞的分離純化、擴增培養及形態特征：倒置生物顯微鏡下觀察，接種后48h，極少數細胞貼壁，呈梭形，4天后細胞呈纖維集落樣生長，大約8～10天，細胞迅速生長并形成克隆，2周左右細胞近80％～90％匯合，出現致密的貼壁層。繼續培養，可見有自發分化的現象出現不典型的聚集的小脂泡。

2．2 人脂肪間充質干細胞的表型特征流式細胞儀檢測結果顯示：脂肪千細胞均一的表達CD44、CD106陽性，而CD34、CD45、CD49d和HLA－DR呈陰性表達。CD49d和CD106是脂肪干細胞和骨髓干細胞的很好的區分標記。冷凍前后的表型鑒定無明顯區別。

2．3 冷凍保存后的人脂肪間充質干細胞存活率及細胞周期的變化：分別將在-70℃低溫冰箱凍存4周、8周和12周的細胞38℃～40℃水浴中復蘇，直接計數活細胞。次日收獲人脂肪間充質干細胞流式細胞儀測定細胞周期，凍存后細胞周期分析結果顯示：我們分離培養的細胞處于G／G1期，僅少數細胞處于活躍的增殖期與凍存前比較沒有明顯的變化。倒置生物顯微鏡下觀察細胞形態，與凍存前比較沒有明顯形態的區別，并且凍存4、8、12周的細胞形態之間沒有明顯差別。實驗結果證實，-70℃凍存的人脂肪間充質干細胞不會明顯改變細胞的細胞周期特點。從本研究的結果來看，凍存前的貼壁細胞應以70％～80％長滿為宜，復蘇后基本完全存活。

2．4 凍存復蘇的人脂肪間充質干細胞的誘導分化：凍存12周后復蘇細胞，檢測細胞多向分化能力。用臘肪誘導體系誘導1周后即有60％～80％的細胞內出現脂肪滴，用油紅染色后在胞漿內出現密集的紅色顆粒。當誘導12天時，100％的細胞出現油紅染色陽性反應。

3 討論

Zuk等的研究建立了人脂肪間充質干細胞分離培養的方法。自此，有關人脂肪間充質干細胞的研究逐漸深入。我們以往的工作分析了人脂肪間充質干細胞的細胞生物學特性，并證實其可以分化為成骨、脂肪等細胞。但是我們發現，細胞在傳代過程中，其細胞形態會發生改變，增殖變緩。甚至細胞發生自發分化現象。為了解決這個問題，并給以后的人脂肪間充質干細胞臨床應用提供有效數量的種子細胞，我們摸索改進了人脂肪間充質干細胞的冷凍保存方法。

在傳統的細胞凍存方法中，一種是程序性降溫凍存法，另一種則是非程序性降溫凍存法，其中包括-80℃～-196℃兩步法和直接-80℃一步法常規的程序性降溫液氮凍存法，其步驟復雜費時，而且需購置費用昂貴的專用儀器。20世紀80年代Till等采用HES／DMSO作為冷凍保護劑，以非程序降溫-80℃冰箱凍存外周血干細胞獲得成功。我們利用DMSO作為冷凍保護劑，探索在70℃冰箱內以非程序降溫凍存消化后的人脂肪問充質干細胞。經過低溫冷凍保存后的細胞經3代傳代，細胞表型和分化潛能不發生明顯改變。解凍后的細胞存活率很高。可見，人脂肪間充質干細胞在-70℃冰箱內短期冷凍保存是一種可行的方法。依據實驗結果我們認為，凍存方法的關鍵在于選擇合適的冷凍細胞密度，這是保證細胞凍存效果的重要條件。細胞密度太小，細胞之間沒有連接，增殖速度會很緩慢。但是如果密度過大，復蘇后的細胞增殖沒有適當的空間使貼壁細胞容易脫落。此外，在人脂肪間充質干細胞的培養工作中我們還發現，過密的貼壁細胞易造成人脂肪間充質干細胞向成纖維細胞分化而使其失去干細胞的特性，表現為細胞增殖緩慢，傳代次數減少。因此，-70℃冰箱內細胞凍存法可以概括為如下優點：①縮短了凍存步驟，短期內并沒有改變細胞的生物學特性；②低溫冰箱凍存細胞不需要液氮及液氮凍存裝置，降低了細胞的凍存成本；③方法簡便快捷、易操作，能較快地擴增足量的細胞，大大縮短了培養時間。本研究為人脂肪間充質干細胞的基礎和應用研究提供了保證。