光合細(xì)菌中試生產(chǎn)質(zhì)量管理體系的建立

摘要：對(duì)光合細(xì)菌(PSB)培養(yǎng)的最適溫度、光照、pH等條件及培養(yǎng)基優(yōu)化進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，PSB生長(zhǎng)的最適條件為：溫度30℃，光照強(qiáng)度5000lx，pH8.0。同時(shí)提出從菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境控制、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量監(jiān)控以及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面建立光合細(xì)菌中試生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量管理體系。

關(guān)鍵詞：光合細(xì)菌；中試生產(chǎn)；質(zhì)量管理

中圖分類號(hào)：S939.129 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006－6500(2008)02－0004－03

光合細(xì)菌(photosyntheticbacteria，PSB)由于能有效降解和清除水體環(huán)境中的過(guò)量有機(jī)物和有害物質(zhì)，改善水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上。現(xiàn)在市售光合細(xì)菌生產(chǎn)過(guò)程中缺乏完善的行業(yè)技術(shù)規(guī)范，使產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，菌種純度、活力及有效活菌含量等達(dá)不到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，直接影響了產(chǎn)品的使用效果和養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)利益，而且產(chǎn)品價(jià)格差異較大，企業(yè)之間存在惡性競(jìng)爭(zhēng)等問(wèn)題，不利于行業(yè)的良性發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)室在多年研究和實(shí)踐的基礎(chǔ)上，摸索出PsB中試生產(chǎn)的最適培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件，并提出一套中試生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量管理體系，包括菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境控制、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)量監(jiān)控管理以及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，期望能為PSB的規(guī)范化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.1菌種來(lái)源

PSB菌種為本課題組從養(yǎng)殖池中分離獲得并培養(yǎng)保存，經(jīng)鑒定為紅螺菌科紅假單孢菌屬(Rhodopseu-domonas)。顯微鏡下觀察，菌種形態(tài)為短桿狀或卵圓形。

1.2感官標(biāo)準(zhǔn)及菌液濃度

顏色：紫紅色、褐紅色、暗紅色、深紅色、棕紅色等液體；

氣味：特有香味或淡海腥味；

質(zhì)地：略粘稠，略有沉淀，呈均勻懸濁液；

作為菌種的菌液，活菌濃度達(dá)4×10⁹個(gè)／mL以上，無(wú)雜菌污染。

2 環(huán)境控制和設(shè)備要求

2.1生產(chǎn)車間要求

生產(chǎn)車間由接種室和培養(yǎng)室組成。接種室應(yīng)經(jīng)常保持無(wú)菌狀態(tài)，定期用甲醛熏蒸，定期做無(wú)菌檢查。每次接種前，開(kāi)啟紫外燈進(jìn)行物品表面滅菌20-30min，操作人員進(jìn)入接種室后，戴上一次性手套，并用消毒液清洗手套表面，換上工作服、鞋，戴口罩及工作帽。接種完畢，依次清理物品，脫去工作服、鞋、帽等，將物品移出，開(kāi)紫外燈20～30min。

培養(yǎng)室應(yīng)寬敞明亮，因?yàn)镻SB是光能自養(yǎng)菌，生產(chǎn)車間采光性要好。培養(yǎng)室在每次培養(yǎng)之前應(yīng)開(kāi)啟紫外燈進(jìn)行物品表面滅菌20～30min。進(jìn)入培養(yǎng)室工作人員應(yīng)嚴(yán)格經(jīng)過(guò)更衣、洗手、消毒等程序，避免在生產(chǎn)過(guò)程中使產(chǎn)品感染有害細(xì)菌和其它微生物。

2.2中試設(shè)備要求

PSB中試生產(chǎn)設(shè)備應(yīng)采用透光性好的材料，設(shè)備設(shè)計(jì)應(yīng)充分考慮采光效果。本室采用多柱塔式光合細(xì)菌反應(yīng)器。該設(shè)備主要由透光性好的玻璃材料組成，采取立柱懸空培養(yǎng)的方式，各柱可錯(cuò)位采光且移動(dòng)方便，在光線不足的情況下可以補(bǔ)充人工光源，生產(chǎn)不受時(shí)間和場(chǎng)地的限制。

3 生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量管理

培養(yǎng)基組分、接種量、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間等因素都會(huì)影響PSB生長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量。為了保證PSB中試產(chǎn)品質(zhì)量，從接種至收獲過(guò)程中，要嚴(yán)格控制接種量、培養(yǎng)條件等，并適時(shí)收獲。

3.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)介質(zhì)

優(yōu)化培養(yǎng)基成分：CH₃COONa3.0g，NH₄CI1.0g，NaCl1.0g，MgSO₄0.2g，KH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄0.5g，CaCl₂0.05g，酵母膏0.5g，微量元素1mL，蒸餾水1000mL。

微量元素溶液組成為：EDTA-2Na2g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.2g，MnCl₂·4H₂O0.1g，H₃BO₃0.1g，CoCl₂·6H₂O0.1g，ZnCl₂0.1g，Na₂MoO₄·2H₂O0.02g，NiCl₂·6H₂00.02g，CuCl₂·2H₂O0.01g，蒸餾水1000mL。

PSB生產(chǎn)必須用清潔淡水，水的pH值7.0～8.5為宜，雜菌含量少，低于10000個(gè)／mL。有條件的可采用蒸餾水及純凈水，也可用地下水。地下水硬度低的最好。含氯的自來(lái)水要放置24～48h，或添加適量硫代硫酸鈉中和后使用。

3.2中試生產(chǎn)工藝參數(shù)的控制

3.2.1光照對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響將已接種的PSB培養(yǎng)液在30℃，光強(qiáng)度分別為1000，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，6000lx下培養(yǎng)7d，每組3柱塔式光合反應(yīng)器(除光強(qiáng)度外，其他條件相同)。第7d用分光光度計(jì)測(cè)定OD₆₆₀值(用蒸餾水為空白對(duì)照)，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量菌數(shù)(見(jiàn)表1)。從表1可以看出，PSB在光強(qiáng)度1000－6000lx范圍內(nèi)都可以生長(zhǎng)，且在1000-5000lx范圍內(nèi)的生長(zhǎng)速度隨光強(qiáng)度增強(qiáng)而加快、光照度越強(qiáng)最終的細(xì)菌生物量越多。本試驗(yàn)中光合細(xì)菌最適生長(zhǎng)的光強(qiáng)度為4000～5000lx，在生產(chǎn)過(guò)程中可根據(jù)PSB反應(yīng)器的內(nèi)徑適當(dāng)?shù)恼{(diào)整光強(qiáng)度，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)為了節(jié)約成本可以選擇自然光照培養(yǎng)。

3.2.2溫度對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響將接種的PSB分別置于15，20，25，30，35，40℃條件下培養(yǎng)(除溫度外，其它條件相同)，每個(gè)處理3次重復(fù)。每天測(cè)菌液的OD值(660nm)和菌數(shù)，等菌液濃度開(kāi)始下降時(shí)停止試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。PSB最適生長(zhǎng)溫度為30℃，在25～35℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，且差別不大，當(dāng)溫度達(dá)40℃時(shí)PSB生長(zhǎng)受到明顯抑制。因此，在平時(shí)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)將溫度控制在25～35℃即可。

3.2.3初始pH值對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響將菌液的初始pH值分別設(shè)9.0，8.5，8.0，7.5，7.0，6.5共6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期間測(cè)菌液OD值和菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。PSB在pH值6.5-9.0之間均能正常生長(zhǎng)，在pH8.0時(shí)生長(zhǎng)最好，其次是pH8.5。在培養(yǎng)PSB的過(guò)程中，必須隨時(shí)注意酸堿度的變化，過(guò)高或過(guò)低的pH值都不利于PSB生長(zhǎng)。PSB本身在繁殖過(guò)程中，由于底物的消耗及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物使菌液的pH值逐漸上升，進(jìn)入衰亡期后pH值開(kāi)始下降。因此在生產(chǎn)過(guò)程中也可通過(guò)監(jiān)測(cè)菌液pH值的變化來(lái)控制菌液的發(fā)酵時(shí)間。

3.2.4接種量對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響接種量分別為5％，10％，20％，30％，40％和50％的菌液在30℃，4000lx光照下培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中每天測(cè)定OD值和菌數(shù)。從表4得知接種量越高，PSB的生長(zhǎng)越快，達(dá)到最大細(xì)菌生物量的時(shí)間越短。比較不同接種量對(duì)菌液最終濃度的影響發(fā)現(xiàn)，接種量對(duì)最終的細(xì)菌生物量影響不大。接種量大雖然生長(zhǎng)周期較短但成本高，接種量小雖然生長(zhǎng)周期有所延長(zhǎng)但成本降低，因此，大規(guī)模生產(chǎn)中綜合考慮各方面因素，采用20％接種量比較適宜。

3.2.5溶解氧對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響從表5可以看出，在厭氧和微好氧的條件下PSB均能正常生長(zhǎng)，且在微好氧的條件下生長(zhǎng)最好，也就是說(shuō)，PSB反應(yīng)器在密封的條件下應(yīng)留有一定的空氣。試驗(yàn)表明，留5％的空氣培養(yǎng)比完全不留空氣的PSB生長(zhǎng)要快。

3.2.6生長(zhǎng)周期用多柱塔式PSB反應(yīng)器，溫度30℃，pH8.0～8.5，接種量20％，自然光照培養(yǎng)(光照達(dá)4000～5000lx)，7～9d能達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，菌液濃度一般在4×10⁹個(gè)／mL。在菌液進(jìn)入穩(wěn)定期后，若不斷補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，并及時(shí)不斷以同樣體積排出培養(yǎng)物，則可連續(xù)培養(yǎng)。

PSB培養(yǎng)過(guò)程中必須攪拌，其作用是幫助沉淀的PSB上浮，以更好接觸培養(yǎng)基加快繁殖，并可使受光均勻，保持細(xì)菌生長(zhǎng)良好。同時(shí)每天至少用干凈的長(zhǎng)柄毛刷，刷洗玻璃內(nèi)壁兩次，使粘在內(nèi)壁上的PSB菌斑刷下，避免影響光照和培養(yǎng)。

3.3質(zhì)量控制記錄

記錄性文件，即生產(chǎn)過(guò)程中的操作步驟、控制條件等都要進(jìn)行詳細(xì)記錄。文件包括以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：(1)各操作步驟完成的日期和時(shí)間；(2)生產(chǎn)過(guò)程中所用原料的數(shù)量(質(zhì)量或其它計(jì)量單位)；(3)中間控制或?qū)嶒?yàn)室控制的結(jié)果；(4)對(duì)取樣過(guò)程的詳細(xì)描述；(5)生產(chǎn)重要步驟操作、復(fù)核、監(jiān)督人員的簽名；(6)最終產(chǎn)品檢驗(yàn)記錄。

4 光合細(xì)菌中試產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

連續(xù)工藝生產(chǎn)或按批生產(chǎn)的產(chǎn)品均應(yīng)有生產(chǎn)和質(zhì)量控制記錄，以記錄每批產(chǎn)品生產(chǎn)和質(zhì)量控制相關(guān)的所有信息。不同批次生產(chǎn)的產(chǎn)品應(yīng)達(dá)到以下指標(biāo)方能進(jìn)行包裝出廠：顏色為紫紅色、褐紅色、暗紅色、深紅色或棕紅色，有特殊香味或淡海腥味，菌液粘稠，或略有沉淀，呈均勻懸濁液，菌液pH值在8.0～10.0之間，活菌濃度達(dá)3×10⁹個(gè)／mL以上。

5 小結(jié)

PSB中試生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量主要決定于菌種質(zhì)量、培養(yǎng)條件的優(yōu)化及培養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境控制。本試驗(yàn)在對(duì)各種物理因素對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響進(jìn)行系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，建立了光合細(xì)菌中試生產(chǎn)的質(zhì)量管理體系。在菌種濃度達(dá)4×10⁹個(gè)／mL，接種量20％，光照強(qiáng)度4000-5000lx，pH8.0，溫度30℃，潔凈的中試車間中培養(yǎng)7d左右，菌液的活菌數(shù)可達(dá)4×10⁹個(gè)／mL。在規(guī)模生產(chǎn)時(shí)為節(jié)約成本可采用自然光照，適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵周期。

參考文獻(xiàn)：

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