半定量RT-PCR技術(shù)的研究及應(yīng)用

摘要：介紹了半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)的原理和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中潛在的問(wèn)題，并且討論了該技術(shù)在實(shí)際中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：半定量RT-PCR；反應(yīng)參數(shù)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—6500(2008)01—0010—04

高等生物基因表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)的核心機(jī)制，正是由于基因的差異表達(dá)才決定了生物體的所有生命過(guò)程。因此，研究不同類型細(xì)胞或同一類細(xì)胞在不同發(fā)育時(shí)期或不同發(fā)育狀態(tài)下基因表達(dá)的變化，已成為當(dāng)今生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR，Reverse transcription polymerase chain reac-tion)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段。與傳統(tǒng)的Northern blot法比較，它具有靈敏、簡(jiǎn)捷、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，因此在檢測(cè)基因的表達(dá)水平上得到了廣泛的應(yīng)用。

1 原理

半定量RT-PCR技術(shù)的核心即PCR，是20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)的一種相對(duì)定量的技術(shù)。當(dāng)人們欲利用該技術(shù)研究并揭示某一基因的表達(dá)產(chǎn)物量的改變時(shí)，利用相同量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，再PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳判斷量的差異。為避免樣本間模板質(zhì)量和擴(kuò)增效率的差異而導(dǎo)致最終結(jié)果的差異，在PCR反應(yīng)體系中引入了內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)。在一般情況下大多選用與靶基因序列無(wú)關(guān)的管家基因，如β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和甘油-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等，因?yàn)檫@些基因的轉(zhuǎn)錄比較穩(wěn)定，含量相對(duì)豐富。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使靶基因和“管家基因”在同管或異管中一起擴(kuò)增，在對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時(shí)，首先根據(jù)各樣本間“管家基因”擴(kuò)增條帶密度是否一致，粗略地判斷各樣本抽提的效率、質(zhì)量和擴(kuò)增效率是否一致，然后以“管家基因”擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的密度作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出靶基因擴(kuò)增條帶密度與其之比值，并通過(guò)觀察各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物的比值，得出靶基因的表達(dá)量的相對(duì)變化。

2 反應(yīng)參數(shù)

2.1 RNA的質(zhì)量

在運(yùn)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)特異基因表達(dá)量的差異時(shí)，總RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，只有在總RNA未被降解的情況下，才能保證其中mRNA的完整性，從而真實(shí)反映起始模板中基因表達(dá)量的差異。因此，每個(gè)RNA樣品須檢查其完整性和純度，可以通過(guò)瓊脂糖或甲醛變性電泳分析證明總RNA的完整性，一般在電泳圖上會(huì)出現(xiàn)兩條帶28S和18S，且28S的亮度應(yīng)是18S的兩倍。半定量RT-PCR檢測(cè)體系必須防止混在RNA中的基因組DNA帶來(lái)的假陽(yáng)性，所以在抽提后一定要用DNA酶消解殘存在樣品中的DNA。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄(RT)

逆轉(zhuǎn)錄酶AMV或M-MLV能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA，合成模板cDNA，加Rnasin(RNA酶抑制劑)，可獲得最高產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)證明，cDNA合成后殘留的完整mRNA模板干擾RT-PCR，因?yàn)樗ccDNA競(jìng)爭(zhēng)作為PCR模板，而AMV和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的內(nèi)在RNaseH活性足以降解殘存的大多數(shù)mRNA模板。但使用缺乏RnaseH活性的反轉(zhuǎn)錄酶時(shí)，則必須用RnaseH處理cDNA。

在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中另一個(gè)需要考慮的情況是低拷貝RNA的反轉(zhuǎn)錄效率要低于高拷貝RNA，尤其是在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中存在大量非特異和背景RNA時(shí)，這種情況更為明顯，因此反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的線性問(wèn)題應(yīng)該認(rèn)真考慮。解決該問(wèn)題的方法是每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行重復(fù)，看每次重復(fù)的變化程度，如果每次重復(fù)的結(jié)果變化很大，說(shuō)明可能發(fā)生了不穩(wěn)定隨機(jī)現(xiàn)象。

2.3 模板量和反應(yīng)循環(huán)數(shù)

設(shè)計(jì)相對(duì)定量PCR實(shí)驗(yàn)方案時(shí)必須注意預(yù)先確定最佳模板量和PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促反應(yīng)定律，開(kāi)始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)累積，產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系。半定量RT-PCR技術(shù)正是利用產(chǎn)物與模板量的這一線性關(guān)系，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)對(duì)比總RNA中目的基因的表達(dá)。但經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)后，PCR產(chǎn)物不再呈指數(shù)累積而進(jìn)入平臺(tái)期，因此，為避免平臺(tái)效應(yīng)的影響，合適的循環(huán)數(shù)是PCR半定量方法的關(guān)鍵因素之一。循環(huán)次數(shù)因擴(kuò)增目的條帶不同而不同，陳昕等在建立小麥硫蛋白基因半定量RT-PCR檢測(cè)方法時(shí)，目的基因和內(nèi)參的循環(huán)次數(shù)分別為30和24次。石艷麗等人在用此方法測(cè)定鏈球菌透明質(zhì)酸合酶mRNA的水平時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果目的基因和內(nèi)參的循環(huán)次數(shù)分別為30和35次。盧建雄等在檢測(cè)生脂基因時(shí)則均確定為28次。Kim在研究垂體瘤細(xì)胞時(shí)循環(huán)次數(shù)為26次。

在逆轉(zhuǎn)錄之前，總RNA的定量也是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，用等量的RNA作為起始模板，從而保證隨后的PCR擴(kuò)增條帶亮度的差異，能夠真實(shí)反映基因表達(dá)的實(shí)際情況。

2.4 Mg²⁺濃度對(duì)擴(kuò)增效率的影響

Mg²⁺是影響Taq酶擴(kuò)增效率的重要因素，濃度范圍在0.5～5mmol/L，但擴(kuò)增效率視序列而定。徐春蘭等的研究表明Mg²⁺對(duì)細(xì)胞谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因擴(kuò)增的影響較大，濃度在0.5～1mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率不理想，條帶較淡，進(jìn)一步應(yīng)用分析軟件對(duì)電泳條帶IOD值進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在1.5mmol/L時(shí)擴(kuò)增效率及特異性良好。而對(duì)于小麥硫蛋白基因的檢測(cè)結(jié)果，能同時(shí)穩(wěn)定擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參的Mg²⁺濃度分別為1.7mmol/L和1.9mmol/L。

2.5 引物的影響

2.5.1 引物間的競(jìng)爭(zhēng) 利用RT-PCR技術(shù)對(duì)mRNA進(jìn)行檢測(cè)時(shí)一般要在同一管中對(duì)內(nèi)參照和目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。要在同一管中有效擴(kuò)增出內(nèi)參照和目的基因產(chǎn)物，并在凝膠電泳上清晰顯現(xiàn)，同時(shí)消除引物對(duì)間可能的競(jìng)爭(zhēng)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，除滿足引物設(shè)計(jì)的基本要求外，還應(yīng)考慮引物擴(kuò)增的預(yù)期退火溫度，特異基因和內(nèi)參照引物的預(yù)期退火溫度盡量相符；引物序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，二者應(yīng)無(wú)同源性；產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)有一定差異，以免電泳時(shí)重疊。如果目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增動(dòng)態(tài)曲線表明，二者處于線性期的循環(huán)次數(shù)相差過(guò)大，卻直接同管擴(kuò)增，則兩者的產(chǎn)物量受到競(jìng)爭(zhēng)，擴(kuò)增效率降低，這時(shí)可選用同批異管擴(kuò)增，并在不同循環(huán)次數(shù)下分別取出二產(chǎn)物。

2.5.2 引物的設(shè)計(jì) 在選擇PCR引物時(shí)，盡量使上游和下游引物跨越不同外顯子，這樣能把從cD-NA得到的擴(kuò)增產(chǎn)物和從任何污染的包含內(nèi)含子序列的基因組DNA得到的產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)(圖1)。最佳的序列引物是完全精確與cDNA模板互補(bǔ)，在cDNA序列中，定位模板引物的重要理由是：(1)它確定PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度，應(yīng)選擇擴(kuò)增400～2000bp產(chǎn)物的模板引物位點(diǎn)，因?yàn)樾∮?00bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，需要高分辨率的特殊瓊脂糖凝膠區(qū)分，并且引物和引物假象可導(dǎo)致模糊不清；大于2000bp的產(chǎn)物，受酶作用性能的限制，難以有效擴(kuò)增，如TaqDNA聚合酶，延伸長(zhǎng)鏈則完全無(wú)效，而且易于脫離模板。此外，引物序列與其它轉(zhuǎn)錄基因完全同源時(shí)，會(huì)產(chǎn)生更多的偽假PCR產(chǎn)物。計(jì)算機(jī)軟件程序和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)很便利于引物設(shè)計(jì)，但也必須多次試驗(yàn)，才能確定最適引物。

2.6 其它因素的影響

除了對(duì)上述所提到的幾種關(guān)鍵因素進(jìn)行選擇外，還要相應(yīng)的調(diào)整dNTP、Taq酶濃度等其它的一些參數(shù)來(lái)提高反應(yīng)的特異性及靈敏度，最大限度的提高方法本身的可靠性。

3 RT-PCR技術(shù)的應(yīng)用

3.1 對(duì)動(dòng)物和植物基因表達(dá)變化的分析

在動(dòng)植物表達(dá)分析中，常常用到的是實(shí)時(shí)定量PCR、Northern blot、基因芯片等半定量技術(shù)，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要特殊的儀器，而半定量RT-PCR技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于此類研究中。

陳昕等(2006)在研究小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)時(shí)建立了半定量RT-PCR方法。徐春蘭和汪以真(2005)用半定量RT-PCR法評(píng)定了不同生長(zhǎng)階段豬抗菌肽pr-39基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示，不同生長(zhǎng)階段豬pr-39基因表達(dá)有差異，從出生到斷奶前pr-39表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，斷奶時(shí)表達(dá)量下降，斷奶后隨日齡增加pr-39表達(dá)量再逐漸增加。因此，在斷奶期通過(guò)添加某些養(yǎng)分，促進(jìn)pr-39基因的表達(dá)，對(duì)于提高仔豬的抗病能力具有重要意義。石艷麗等用半定量RT-PCR法測(cè)定鏈球菌透明質(zhì)酸合酶mRNA的水平，這對(duì)于深入探討透明質(zhì)酸發(fā)酵有重要意義。

3.2 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

半定量RT-PCR技術(shù)自建立以來(lái)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。周林福等對(duì)熒光定量PCR與半定量PCR檢測(cè)HBV DNA做了對(duì)比分析，結(jié)果證明，臨床基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室可用半定量PCR法替代熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBVDNA的載量，這為臨床基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供了方法學(xué)選擇依據(jù)。Gao等利用該方法確定了人類重組的骨格形成素基因BM P-2在煙草不同組織中的表達(dá)量的差異，結(jié)果表明莖和根的表達(dá)要高于葉片組織，這使人們能有目的的以煙草為生物反應(yīng)器為人類服務(wù)。張鴻來(lái)等用半定量PCR方法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞67-KD LN-R mRNA的應(yīng)用獲得成功，其簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)更適合于臨床應(yīng)用。

綜上所述，我們可以看出半定量RT-PCR是一種粗略地估計(jì)基因表達(dá)的相對(duì)變化的方法，若要精確地計(jì)算基因的表達(dá)量還需利用實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)，但多數(shù)研究的焦點(diǎn)并不是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平微小的變化或確切的分子數(shù)目，而是檢測(cè)其表達(dá)水平變化是否顯著。所以，半定量分析mRNA水平的方法在各個(gè)研究領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用，隨著該技術(shù)的日趨成熟和完善，它將成為研究者的強(qiáng)有力的研究手段。