粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵工藝參數(shù)研究

摘要：研究了發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、接種量及溶解氧等對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響，得出粘質(zhì)沙雷氏菌的優(yōu)化培養(yǎng)條件為溫度30℃左右，pH7.0～7.5，接種量1：10，通過振蕩或通氣的方法保證培養(yǎng)基中含一定的溶解氧有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。用發(fā)酵罐測(cè)定了粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線，在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下粘質(zhì)沙雷氏菌約4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18h達(dá)到穩(wěn)定期，最終菌液濃度達(dá)16.00億/mL。

關(guān)鍵詞：粘質(zhì)沙雷氏菌；發(fā)酵工藝參數(shù)；生長(zhǎng)曲線

中圖分類號(hào)：S476⁺.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—6500(2008)01—0014—03

生物防治是一種環(huán)境友好、無毒害、無殘留的防治植物病蟲害的方法，在現(xiàn)代的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用，而獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)。粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性菌，它能侵染多種昆蟲的幼蟲和成蟲，是一類重要的昆蟲病原菌。另外，還可誘導(dǎo)煙草、黃瓜、番茄、辣椒等植物產(chǎn)生抗性，抵抗多種病原物的侵襲，具有潛在的生防價(jià)值。

本課題組從棉鈴蟲尸體中分離到一株粘質(zhì)沙雷氏菌，試驗(yàn)證明其活菌制劑和代謝產(chǎn)物對(duì)煙青蟲、菜青蟲、棉鈴蟲、小菜蛾等蔬菜常見的鱗翅目害蟲均具有一定的致病力。本研究對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行了摸索，期望通過優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高活菌濃度和代謝產(chǎn)物含量，從而提高粘質(zhì)沙雷氏菌的生防效果，為無公害農(nóng)藥的研發(fā)提供有價(jià)值的生物防治拮抗菌。

1 材料和方法

1.1 材料

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA培養(yǎng)基)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，固體培養(yǎng)基每升加瓊脂粉14g。

菌種：供試菌種為本課題組分離篩選并經(jīng)鑒定的粘質(zhì)沙雷氏菌。首先用接菌環(huán)挑試管斜面保存的菌種在NA培養(yǎng)基平板上劃線，于30℃活化1d，再挑平板上的菌種轉(zhuǎn)接到150mL三角瓶中(內(nèi)含50mL培養(yǎng)基)，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)2d，然后將菌液按10％的接種量轉(zhuǎn)接到250mL的三角瓶中(內(nèi)含培養(yǎng)基100mL)，30℃，150r/min，振蕩培養(yǎng)1d作為菌種。

儀器：5L全自動(dòng)發(fā)酵罐(B10STATB德國(guó))；水浴搖床(HZS-H哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；顯微鏡(XSY-S重慶光學(xué)儀器廠)；超凈工作臺(tái)(SW-CI-2F吳江市匯通空調(diào)凈化設(shè)備廠)；752紫外可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 溫度對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)設(shè)22，26，30，35℃共4個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)。將液體菌種以1：10的接種量轉(zhuǎn)接到含100mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后置于不同溫度處理的搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)數(shù)150r/min。試驗(yàn)開始后每4h取一次樣測(cè)菌液的吸光度值(540nm)，當(dāng)所測(cè)吸光度值有所下降終止試驗(yàn)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.2 pH對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響 用稀鹽酸將培養(yǎng)基分別調(diào)至pH6.5，7.0，7.5，8.0，每個(gè)pH處理3個(gè)重復(fù)。將液體菌種以1：16的接種量轉(zhuǎn)接到含100mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后置于搖床振蕩培養(yǎng)，30℃，150r/min。試驗(yàn)開始后每3h取一次樣測(cè)菌液的吸光度值，當(dāng)所測(cè)吸光度值有所下降終止試驗(yàn)。

1.2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將液體菌種以1：10的比例接種到全自動(dòng)發(fā)酵罐中，根據(jù)搖瓶試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定發(fā)酵參數(shù)：溫度30℃，pH7.2，攪拌速度250r/min，通氣量4L/min。接種后每2h取樣測(cè)菌數(shù)和菌液吸光度值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液的吸光度值和菌數(shù)為縱坐標(biāo)繪制粘質(zhì)沙雷氏菌在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響

從圖1和表1可以看出，溫度是限制粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的一個(gè)關(guān)鍵因子，在一定的溫度范圍內(nèi)粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)速率隨溫度的升高而加快，最大菌液濃度也隨溫度升高而增大，過高的溫度會(huì)抑制粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)。在22℃處理下，細(xì)菌生長(zhǎng)比較緩慢，32h后未進(jìn)入穩(wěn)定期，試驗(yàn)所測(cè)最大菌液濃度為7.55億/mL；26℃處理下，細(xì)菌生長(zhǎng)相對(duì)較快，約在28h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液濃度為10.75億/mL；30℃處理下，細(xì)菌生長(zhǎng)速率明顯加快，培養(yǎng)約24h后達(dá)到穩(wěn)定期，最大菌液濃度達(dá)12.70億/mL；35℃處理下細(xì)菌生長(zhǎng)也較快，約20h后進(jìn)入穩(wěn)定期，但最大菌液濃度只有9.25億/mL，僅高于22℃處理。由此可見，粘質(zhì)沙雷氏菌的最適生長(zhǎng)溫度為30℃左右，過高或過低的溫度都會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，而適宜的溫度不僅能縮短菌液的發(fā)酵周期還能提高菌液的活菌濃度。

2.2 pH對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，不同pH處理下粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)步調(diào)比較一致，前12h各處理的增長(zhǎng)速度相對(duì)比較緩慢，12h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，33h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液濃度達(dá)到最高值。在不同的處理之間，前18h吸光度值差異較小，21h后pH7.0的處理在各個(gè)測(cè)量點(diǎn)吸光度值最大，其次為pH7.5的處理，pH8.0的吸光度值最低。這就說明粘質(zhì)沙雷氏菌最適生長(zhǎng)的pH值范圍為7.0～7.5。oH值偏高或偏低對(duì)其生長(zhǎng)有一定的抑制作用。本試驗(yàn)中不同pH處理的發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)33h，比溫度處理試驗(yàn)中30℃處理的發(fā)酵周期長(zhǎng)9h，這主要是因?yàn)楸驹囼?yàn)的接種量(1：16)較溫度處理試驗(yàn)(1：10)低。這也說明接種量對(duì)菌液發(fā)酵周期有很大的影響，在實(shí)際操作中應(yīng)將成本和需要結(jié)合起來控制好接種量。

2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線

從圖3可以看出，粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。在保證通氣和溫度的情況下，粘質(zhì)沙雷氏菌在4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，約18h后達(dá)到穩(wěn)定期，菌液濃度達(dá)16億/mL，其后菌液進(jìn)入衰亡期。在所測(cè)的數(shù)據(jù)中，由于取樣點(diǎn)時(shí)間間隔較長(zhǎng)，菌液的穩(wěn)定期不是特別明顯。從生長(zhǎng)曲線得知粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)較快，穩(wěn)定期時(shí)間較短，因此，掌握合理的發(fā)酵時(shí)間對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)意義非常重大，在菌液達(dá)到最高值后應(yīng)立即終止發(fā)酵，這樣既節(jié)約時(shí)間也保證了菌液的活性。在發(fā)酵罐通氣的狀態(tài)下粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵周期控制在18～24h較為合理。

從圖3還可以看出，菌液的吸光度值隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與菌液濃度的變化趨勢(shì)一致，說明菌液濃度與吸光度值存在一定的正相關(guān)關(guān)系。將吸光度值與菌液濃度(共37組數(shù)據(jù))進(jìn)行線性回歸，求得的回歸方程為Y=10.04X-1.7673(圖4)，式中的Y為菌液濃度，單位108個(gè)/mL，X為菌液在波長(zhǎng)為540tim處的吸光度值，回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R²=0.9318，說明相關(guān)關(guān)系顯著。因此，可用菌液的吸光度值來做粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線，根據(jù)吸光度值的變化判斷菌液所處發(fā)酵階段，準(zhǔn)確的掌握發(fā)酵時(shí)間，此方法較簡(jiǎn)便還可減少人為誤差。

2.4 溶解氧對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響

粘質(zhì)沙雷氏菌為好氧微生物，比較2.1搖瓶試驗(yàn)和2.3發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在溫度、培養(yǎng)基pH和接種量都一致的情況下，發(fā)酵罐試驗(yàn)由于發(fā)酵過程中不斷通空氣其發(fā)酵周期為18h，較搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵周期短6h；最大菌液濃度為16.00億/mL，較搖瓶試驗(yàn)的最大菌液濃度高。說明培養(yǎng)基中保持適當(dāng)?shù)娜芙庋跤欣诩?xì)菌的生長(zhǎng)，不僅可以縮短菌液的發(fā)酵周期還可以提高菌液的最終濃度。

3 結(jié)論

本研究探討了發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、接種量及溶解氧等對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌生長(zhǎng)的影響，并用發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)測(cè)定了粘質(zhì)沙雷氏菌的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)在溫度30℃，pH7.2，攪拌速度250r/min，通氣量4L/min，接種量1：10的條件下，粘質(zhì)沙雷氏菌約4h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在18h達(dá)到穩(wěn)定期，最終的菌液濃度為16.00億/mL。綜合搖瓶試驗(yàn)和發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果得出，粘質(zhì)沙雷氏菌的最佳培養(yǎng)條件為溫度30℃左右，pH7.0～7.5，接種量1：10，通過振蕩或通氣的方法保證培養(yǎng)基中含一定的溶解氧有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，發(fā)酵罐試驗(yàn)發(fā)酵周期一般控制在18～24h，搖瓶試驗(yàn)其發(fā)酵周期控制在24～30h較為適宜。