中藥添加劑對(duì)雞腸道消化酶及微生物數(shù)量影響的研究

摘要：通過(guò)飼料中添加黃連、大豆，來(lái)研究中藥添加劑對(duì)雞腸道蛋白酶、淀粉酶活力和微生物數(shù)量的影響。結(jié)果表明，用添加0.5％黃連和10％大豆的飼料喂養(yǎng)可提高雞腸道的蛋白酶、淀粉酶活性；飼喂黃連的雞，其腸道中的乳酸菌和大腸桿菌比對(duì)照組少，雙歧桿菌比對(duì)照組多；飼喂大豆的雞，乳酸菌和雙歧桿菌比對(duì)照組多，大腸桿菌比對(duì)照組少。

關(guān)鍵詞：黃連；大豆；蛋白酶；淀粉酶；培養(yǎng)基；腸道微生物

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—6500(2008)01—0025—04

黃連為毛茛科黃連屬植物，國(guó)產(chǎn)黃連原植物包括黃連(Coptis chinensis)、短萼黃連(C.chinen-sis)、三角葉黃連(C.deltoidea)、峨眉黃連(C.omeiensis)和云南黃連(C.teeta)等，作為中藥，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，13部宋代以前的方書(shū)中有3.2萬(wàn)個(gè)方劑，含黃連的方劑有1760種，約占5％左右。據(jù)《全國(guó)中成藥品種目錄》統(tǒng)計(jì)，以黃連作原料的中成藥品種有黃連上清丸、復(fù)方黃連素片、加味香連丸等108種。20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著“黃連”用途的廣泛應(yīng)用，我國(guó)和日本學(xué)者對(duì)黃連的研究逐漸深入，對(duì)黃連屬植物的分類(lèi)學(xué)、形態(tài)學(xué)、成分化學(xué)、生藥鑒定學(xué)和藥理學(xué)等進(jìn)行了研究，在與發(fā)展黃連生產(chǎn)密切相關(guān)的栽培技術(shù)、野生資源保護(hù)、藥材質(zhì)量等方面也取得了一定進(jìn)展。隨著國(guó)際上天然藥物的應(yīng)用熱潮，特別是日本對(duì)黃連解毒湯的深入研究和大量應(yīng)用，黃連出口量進(jìn)一步增加。近年來(lái)，黃連及復(fù)方的藥理和臨床研究又有了新的發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，引起了人們對(duì)中藥黃連及黃連屬植物的特別關(guān)注。

黃連，以根莖入藥。其味苦，性寒，有解熱、清火、止嘔等功效。由于其具有抗菌消炎功效，被用于抑制大腸桿菌、幽門(mén)螺桿菌等多種致病菌的增殖生長(zhǎng)。而黃連在腸道中對(duì)各種酶活性和腸道菌數(shù)量的影響卻未見(jiàn)有報(bào)道。

目前，關(guān)于大豆的開(kāi)發(fā)也比較熱門(mén)，因?yàn)榇蠖怪泻挟慄S酮、胰蛋白酶抑制劑、亞麻酸、凝集素等多種可利用的成分。而用未經(jīng)加工處理的大豆喂養(yǎng)畜禽經(jīng)常會(huì)使畜禽發(fā)生消化不良、腹瀉、腹脹等癥狀，這是因?yàn)榇蠖怪泻心芤种颇c道消化酶的成分。如果對(duì)大豆進(jìn)行加工處理，把不好的成分消除，則大豆就會(huì)變成更可利用的資源。到目前為止，大豆在畜禽腸道中對(duì)腸道消化酶及菌群的影響很少見(jiàn)有報(bào)道，這方面的研究是否可行也是值得探討的。

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定腸道蛋白酶、淀粉酶活力和微生物數(shù)量來(lái)研究中藥添加劑對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響，以研究中藥添加劑對(duì)畜禽生長(zhǎng)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、全溫振蕩培養(yǎng)箱、可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 材料

1.2.1 黃連 購(gòu)自于重慶市朝天門(mén)中藥材市場(chǎng)；大豆購(gòu)自重百超市，粉碎；5日齡肉仔雞購(gòu)于歇馬農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；基礎(chǔ)飼料正大飼料。

1.2.2 培養(yǎng)基 乳酸菌培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄ 2g，檸檬酸三銨2.g，MgSO₄ 0.5g，MnSO₄ 0.25g，吐溫-80 1mL，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH6.2～6.6(含糖菌需115℃滅菌30min)；雙歧桿菌培養(yǎng)基：蛋白胨10g，胰胨5g，吐溫801mL，B液(MgSO₄10g，F(xiàn)e₂SO₄ 0.05g，NaCl 0.5g，MnSO₄ 0.337g，蒸餾水250mL)5.0mL，L-半光氨酸0.2g，1.6％溴甲酚紫1.4mL，蒸餾水1000mL，pH7.1-7.3；大腸桿菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g，酵母粉2.5g，NaCl 5g，蒸餾水500mL。

1.2.3 試劑 福琳一酚試劑，0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液，0.4mol/L碳酸鈉溶液，pH值3.0～6.0醋酸緩沖液，2％酪蛋白底物緩沖液，碘貯存液，碘稀釋液0.01mL/L。

1.3 樣品準(zhǔn)備

試驗(yàn)用5日齡肉仔雞35只，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分為大豆組和中藥組，每組2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1籠7只雞。試驗(yàn)雞全部采用自由采食和自由飲水，試驗(yàn)期為10d。對(duì)照組喂基礎(chǔ)飼料；大豆組喂10％大豆+基礎(chǔ)飼料；中藥組喂0.5％黃連+基礎(chǔ)飼料。

喂養(yǎng)10d后每個(gè)雞籠隨機(jī)選取2只雞進(jìn)行取樣，摘取腸道后置于裝有生理鹽水的玻璃皿中，在超凈工作臺(tái)中，用食指和中指夾住腸往下刮，腸道內(nèi)容物分別用滅菌管收集，標(biāo)上對(duì)應(yīng)的標(biāo)號(hào)，冷藏備用。去掉內(nèi)容物的腸道，去除其表面雜質(zhì)和脂肪，用蒸餾水洗凈，腸道和蒸餾水按1：9的比例放在融漿機(jī)里融成漿液，分別收集待用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 蛋白酶活力測(cè)定

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定。

取15支試管分成5組編號(hào)(每組3支，平行樣)，按比例分別加入標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸、去離子水、0.4mol/L的碳酸鈉和福林一酚試劑，混勻后放入40℃水浴保溫20min，然后在波長(zhǎng)660nm下進(jìn)行比色測(cè)定。以濃度為0g/mL酪氨酸反應(yīng)液做空白對(duì)照。測(cè)定結(jié)果如表1，用福林一酚試劑法測(cè)定的胰酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=7.4×10^-3x+4×10^-3，r=0.9996。(說(shuō)明：胰酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20～80μg/mL范圍內(nèi)，其活性測(cè)定的光密度值與濃度呈線(xiàn)性相關(guān))。

(2)樣品中蛋白酶的測(cè)定。

腸道漿液的每個(gè)樣分別取1mL于3支試管內(nèi)，一支為空白管，另兩支為試驗(yàn)管。在空白管內(nèi)加入0.4mol/L的TCA溶液2mL，使酶失去活性。在試驗(yàn)管內(nèi)分別加入1mL pH7.0濃度為2％的酪蛋白底物緩沖液，迅速混勻，并立即放入40℃恒溫水浴，準(zhǔn)確記時(shí)，保濕10min后，試驗(yàn)管中立即加入0.4mol/L的TCA溶液2mL終止反應(yīng)。同時(shí)，往空白管中加入1mL 2％的酪蛋白底物緩沖液，搖勻，繼續(xù)于水浴中保溫20min，取出，離心或過(guò)濾除去剩余酪蛋白沉淀物。然后取各管濾液1mL，分別移入另三支試管中，再加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL和福林酚試劑1mL，搖勻，保濕顯色20min后，進(jìn)行比色測(cè)定(波長(zhǎng)660mm)，記錄各管吸光度值。將所測(cè)得的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行對(duì)照，得出相應(yīng)的酪氨酸含量。進(jìn)一步根據(jù)單位定義推算蛋白酶活力。

蛋白酶活性定義：1mL酶液在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位U。

蛋白酶活力=M×4×N/10。其中，M為酪氨酸釋放量；4為從4mL反應(yīng)液中取出1mL；N為稀釋倍數(shù)(此處N=1)；10為反應(yīng)時(shí)間。

1.4.2 淀粉酶活性測(cè)定 淀粉緩沖液先在37℃預(yù)溫5min。取三支試管，一支為空白管，另兩支為測(cè)定管。分別在每管內(nèi)加入1mL淀粉緩沖液，然后在測(cè)定管內(nèi)各加0.5mL腸道漿液(空白管不加)，混勻，置于37℃水浴保溫7.5min，取出后沸水滅活2min，滅活后每管分別加1.0mL碘稀釋液。最后，空白管加6.5mL蒸餾水，試驗(yàn)管加6.0mL蒸餾水，混勻，以波長(zhǎng)660nm，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管吸光度。計(jì)算公式為：

淀粉酶(U)=(A空白A測(cè)定)/A空白×1/5×15/7.5×100/0.2

1.4.3 腸道菌群數(shù)量的測(cè)定 用滅菌玻璃棒取腸道內(nèi)容物0.5g于含有稀釋液的無(wú)菌試管內(nèi)，充分震蕩，混勻后作為第一稀釋液10^-1，吸取該稀釋液0.2mL加入到裝有1.8mL稀釋液的試管內(nèi)為第二稀釋液，如此依次稀釋至10^-9。選擇10^-7、10^-8、10^-9三種稀釋度分別接種于自制的乳酸菌培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、大腸桿菌培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度分別滴種3滴。

大腸桿菌于37℃條件下在普通培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。雙歧桿菌和乳酸菌在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72h。以菌落的可數(shù)性來(lái)選擇計(jì)算菌落的稀釋度，再計(jì)算每克糞便中該菌落的個(gè)數(shù)。

每克糞便中的菌數(shù)(CFU/g)=(平均菌落數(shù)/滴數(shù)/mL)×滴數(shù)/mL×稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

雞腸道中蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，飼喂黃連的雞，其蛋白酶活力明顯比對(duì)照組大許多；飼喂大豆的雞，其蛋白酶活性也比對(duì)照組高，但比黃連組要低。

2.2 淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果

雞腸道中淀粉酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可知，飼喂黃連的雞，其淀粉酶活性比對(duì)照組和大豆組的都高，飼喂大豆的雞，其淀粉酶活性也比對(duì)照組高。

2.3 微生物數(shù)量變化結(jié)果

雞腸道中微生物數(shù)量的變化結(jié)果見(jiàn)表4。從表中可知，飼喂黃連的雞，其腸道中的乳酸菌和大腸桿菌比對(duì)照組少，雙歧桿菌比對(duì)照組多；飼喂大豆的雞，其乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量比對(duì)照組多，但大腸桿菌比對(duì)照組少。

3 結(jié)論與討論

(1)黃連組的蛋白酶活力比對(duì)照組大，說(shuō)明飼喂混有0.5％黃連的雞，其腸道內(nèi)蛋白酶活力明顯增高。這可能是因?yàn)辄S連能刺激雞腸道消化腺分泌更多的蛋白酶，從而使雞更好的分解腸道內(nèi)的蛋白類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，也提高對(duì)蛋白類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收。相比，大豆組約高于對(duì)照組，說(shuō)明大豆對(duì)蛋白酶影響不大。由大豆組和黃連組對(duì)比看，黃連組比大豆組要高，說(shuō)明喂養(yǎng)黃連比喂養(yǎng)大豆對(duì)雞腸道蛋白酶活力的影響更大。飼喂混有黃連的飼料更能增加腸道蛋白酶，更有助于雞對(duì)飼料蛋白的消化吸收，提高飼料的利用率。

(2)黃連組淀粉酶活力比對(duì)照組高，說(shuō)明以0.5％黃連混合飼料喂養(yǎng)雞后，黃連在雞腸道內(nèi)能夠提高腸道內(nèi)淀粉酶的活力。由于淀粉酶主要是用于分解禽類(lèi)腸道中飼料的淀粉類(lèi)成分，比如大豆小麥中的淀粉類(lèi)成分，若淀粉酶活力提高則可使禽類(lèi)更好的消化吸收飼料中的淀粉類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分，提高飼料的利用率。說(shuō)明黃連在消化淀粉這方面是有價(jià)值的。

大豆組的淀粉酶活力比對(duì)照組的高但又比黃連組的低。說(shuō)明飼喂混有大豆的飼料也有增加雞腸道淀粉酶活力的作用，但其增加的程度卻不及黃連。喂養(yǎng)大豆特別是長(zhǎng)時(shí)間喂養(yǎng)，雞常常有不消化，甚至腹瀉等癥狀，機(jī)能狀態(tài)還不如對(duì)照組好。因?yàn)椋唇?jīng)任何加工處理的大豆中還含有胰蛋白酶抑制劑活性成分。因此在畜禽生產(chǎn)方面，未經(jīng)加工的大豆最好不要長(zhǎng)時(shí)間過(guò)量的用于喂養(yǎng)。

黃連組的淀粉酶活力比大豆組的高。由黃連組與對(duì)照組比較已經(jīng)得知黃連具有增加腸道淀粉酶活力的作用，加上黃連具有抗菌等效果，混合飼料喂養(yǎng)可使雞腸道淀粉酶活力增高，因此就利用價(jià)值來(lái)看，黃連無(wú)疑是理想的添加劑。

(3)在培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，黃連組的腸道乳酸菌和大腸桿菌比對(duì)照組偏低，說(shuō)明黃連具有抑制腸道菌的作用，但并不是對(duì)所有的腸道菌都有抑制，而是選擇性的抑制某些對(duì)畜禽生長(zhǎng)有害的菌。雙歧桿菌則比對(duì)照組偏高。所以，用添加0.5％黃連的飼料喂養(yǎng)影響了雞的腸道菌群。而對(duì)雙歧桿菌沒(méi)有影響，比對(duì)照組偏高的原因還有待研究。

大豆組的腸道內(nèi)菌數(shù)明顯比黃連組的要高很多。因?yàn)椋蒙蠖刮桂B(yǎng)雞時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間(10d)會(huì)出現(xiàn)腹脹、腹瀉、消化不良等癥狀，可知在大豆喂養(yǎng)的雞腸道內(nèi)菌群發(fā)生了顯著的變化，甚至產(chǎn)生了不利于健康生長(zhǎng)的菌，并且沒(méi)有得到抑制，因而對(duì)雞的生長(zhǎng)產(chǎn)生不好的影響。

以上是對(duì)雞腸道中蛋白酶、淀粉酶及微生物數(shù)量的分析，可知，飼喂適量黃連對(duì)雞的生長(zhǎng)是有利的，在將來(lái)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，考慮在飼喂上如何合理應(yīng)用黃連是有研究?jī)r(jià)值的。