強脈沖光不同脈寬對豚鼠皮膚色素和表皮黑素細胞影響的實驗觀察

[摘要]目的：評價強脈沖光不同脈寬對豚鼠皮膚色素及表皮黑素細胞的影響。 方法：用三種脈寬分別照射三組豚鼠，分不同階段取材，觀察皮膚色素及表皮黑素細胞的變化。 結(jié)果：對每次照射后的色素變化作統(tǒng)計學比較，發(fā)現(xiàn)高脈寬的能量組去除色素效果優(yōu)于另外兩組（P＜0.05），并且透射電鏡觀察該組黑素細胞的細胞器變性明顯，但細胞核和細胞膜完整。 討論：強脈沖光的較長脈寬，可以使較高能量治療的安全性提高，效果優(yōu)于短脈寬。

[關(guān)鍵詞]強脈沖光；脈寬；色素；黑素細胞；

[中圖分類號]R318.51Q251[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-04

Effects of three kinds of pulses width from IPL on skin melanin and epidermal melanocytes of guinea pigs

XU Fang，LI Da-tie，YANG Ning

(Aesthetic Hospital，Zunyi Medical College，Zunyi 563003，Guizhou，China)

Abstract: ObjectiveTo evaluate the effects of different pulses width from IPL on skin melanin and epidermal melanocytes of guinea pigs. Methods Three kinds of pulses width were used on the skin of guinea pigs. Multiple biopsies were taken in different stages， and through light microscopic and transmission electron microscopic we observe the variation of skin melanin and epidermal melanocytes. ResultsThe effect of the longer pulse is more superiority than the others（P<0.05）. The melanocyte cell organs of this group degenerate obviously and cell nucleus and cell membrane are integrity. ConclusionThe longer wavelength from IPL can be used to treat epidermal pigmented disease and the synthesis of melanin is probably inhibited.

Key words: IPL; pulses width; melanin; melanocyte

為探求不同脈寬IPL對皮膚色素的影響，筆者以相同波長、不同脈寬的強脈沖光對豚鼠皮膚進行照射，并觀察不同時期豚鼠皮膚色素及表皮黑素細胞的變化，試圖進一步了解脈寬與皮膚色素的影響關(guān)系，特作以下研究報道。

1材料和方法

1.1實驗動物：健康雄性棕色豚鼠10只(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，普通級)，體重0.35～0.45kg，平均0.40kg，鼠齡4月。

1.2主要儀器：紫色蘭朵光子嫩膚儀(PLASMALITE，瑞典醫(yī)學生物有限公司提供)，光譜范圍535～920nm；光斑10mm×20mm；脈寬1～100ms可調(diào)；能量密度最大50J/cm2，與脈寬自動同步調(diào)節(jié)。光學顯微鏡(OLYMPUS)，電子顯微鏡(JEX-1200，PHILIPS公司)。

1.3動物分組：將豚鼠隨機平均分為3組，每只實驗動物背部取3個大小為3cm×3cm的皮區(qū)，皮區(qū)間相距3cm。每個皮區(qū)的膚色及皮膚厚度基本一致，其為強脈沖光照射區(qū)，每組10個皮區(qū)。

1.4強脈沖光照射：在照射前，用彎剪剪除豚鼠背部長毛，電動剃須刀剃凈短毛，并且均勻涂抹冷凝膠約2mm厚。用535nm濾光片，脈寬分別用臨床常用的36.5ms（能量28J/cm2）、脈寬39.8ms（能量30J/cm2）、脈寬46.2ms（能量34J/cm2）的強脈沖光進行照射，因為太高的能量副作用比較大，太低的能量治療效果不理想。照射時光導頭緊貼冷凝膠，但不可壓緊皮膚。光斑不重復，不漏照，操作者要戴防護眼鏡。各組同時照射，每隔一月照射一次，共照射三次。

1.5取材：每組每個照射區(qū)域分別于第一次照射前，照射后5min、1周、1月、2月（第三次照射前）、3月（第三次照射后1月）取電鏡及光鏡標本送檢。其中第一次照射前的取材為正常對照。電鏡標本大小為1mm×1mm，取材后迅速2.5%戊二醛4℃下固定；光鏡標本大小為0.5cm×0.5cm，迅速用20%福爾馬林常溫固定。

1.6電鏡標本的制作與觀察：用2.5%戊二醛固定標本，保存在4℃下，送第三軍醫(yī)大學電鏡中心制成電鏡標本。標本于4℃冰箱內(nèi)固定24h，常規(guī)脫水，包埋，超薄切片(500～1000A)，雙鉛染色。將電鏡標本置于JEX－1200透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.7光鏡標本的制作與黑素含量指數(shù)的測定：常規(guī)石蠟切片HE染色，Lillie亞鐵反應法染色。使用多媒體病理圖像分析系統(tǒng)對Lillie亞鐵反應法染色切片進行黑素含量指數(shù)(melanin content index，MCI)的測定，計數(shù)并攝片。MCI－I：隨機選擇10個基底層含黑素顆粒細胞，測定黑素顆粒面積占細胞總面積的百分比，取平均值；MCI－2：選擇10處表皮，測定受檢基底層和棘細胞層內(nèi)黑素顆粒的面積占該處表皮基底層和棘層總面積的百分比，取平均值。

1.8統(tǒng)計學方法：采用成組t檢驗，使用SPSS l2.0軟件作數(shù)據(jù)處理及分析，檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為有差異，P＜0.01為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1照射前：豚鼠背部強脈沖熒光照射區(qū)剃光毛后見膚色呈棕黑色，光鏡可見基底層黑素顆粒分布廣泛，密度較高，有的甚至達棘層，其MCI-I(x±s)分別是為MCI-1：38.2±6.7；MCI-2：9.0±5.3。電鏡可見黑素細胞呈鈍圓或不規(guī)則形，胞核大，胞漿豐富，胞核旁富含I、II期黑素小體，胞漿周邊可見較多已黑素化的III、IV期黑素小體（圖1）。

2.2照射后5min：直接觀察照射區(qū)可見豚鼠膚色有加深，以46.2ms組明顯，且組織略有腫脹。光鏡下可見黑素顆粒崩解較明顯，部分向上進入棘層及以上皮膚各層，少量進入真皮層。電鏡下黑素細胞的細胞膜以及細胞核完整，黑素小體部分中央出現(xiàn)空泡化，有的崩解為更細小的顆粒，少部分線粒體及高爾基體腫脹明顯（圖2）。統(tǒng)計MCI，結(jié)果顯示：以46.2ms組明顯，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異（P＜0.05）。見表1。

2.3 第一次照射后1周：直接觀察照射區(qū)可見膚色有所減退。光鏡下可見各組的黑素顆粒有所減小，空泡化的基底細胞在原有輪廓的基礎(chǔ)上出現(xiàn)修復傾向。電鏡下大部分黑素小體進一步空泡化，黑素細胞部分線粒體腫脹明顯，有的內(nèi)部嵴斷裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體亦有破壞（圖3）。統(tǒng)計MCI，結(jié)果顯示：以46.2ms組明顯，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異（P＜0.05）。見表2。

2.4第一次照射后1月(第二次照射前)：直接觀察照射區(qū)域見膚色減退，46.2ms組較明顯。光鏡下各組黑素顆粒逐步減少，含泡化的基底細胞修復明顯。電鏡下可見黑素細胞核周邊有I、II期黑素小體，III、IV期已明顯減少，部分線粒體等細胞器變性（圖4）。統(tǒng)計MCI，結(jié)果顯示：以46.2ms組明顯，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異（P＜0.05）。見表3。

2.5第二次照射后1月(第一次照射后2月，第三次照射前)：直接觀察照射區(qū)可見膚色進一步變淺，46.2ms組較明顯，39.8ms組次之。光鏡下觀察各組的黑素顆粒進一步減少，基底層細胞完整，移至棘層以上的粉末狀黑素顆粒消退明顯。電鏡下黑素細胞核周邊III、IV期黑素顆粒殘留較少，I、II期黑素顆粒仍可找到，線粒體及高爾基體變性明顯部分完全破壞（圖5）。統(tǒng)計MCI，結(jié)果顯示：以46.2ms組明顯，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異（P＜0.05）。見表4。

2.6第三次照射后1月(第一次照射后3月)：直接觀察照射區(qū)可見膚色明顯變淺，46.2ms尤為突出，39.8ms組次之。光鏡下觀察各組的黑素顆粒明顯減少。電鏡下黑素細胞核周邊有少量I、II期黑素小體，III、IV期已很難找到，部分線粒體等細胞器變性較明顯。但各組黑素細胞的細胞膜、細胞核完整（圖6）。統(tǒng)計MCI，結(jié)果顯示：以46.2ms組明顯，經(jīng)統(tǒng)計學分析有差異（P＜0.05）。見表5。

3討論

美國加利福尼亞的Patrick Bitter Sr博士于1998年首先報道了光子嫩膚技術(shù)(Photo rejuvenation)[1]，并定義為使用連續(xù)波長的強脈沖光子在低能量密度下的非剝脫性非侵入性嫩膚治療。

強脈沖光本質(zhì)上屬于非相干光，仍屬于普通光而不是激光，是一組波長為400nm～1 200nm的適合皮膚疾患治療的強光混合波[2]。具有高能量的、波長相對集中、脈寬可調(diào)的強光在治療參數(shù)上與激光相類似，同樣可達到選擇性光熱作用原理進行治療，所以在臨床上強脈沖光源被認同為與激光相似的治療技術(shù)。輸出的光波中較短波長的光因其處于黑色素的吸收峰，故可被皮膚中的色素優(yōu)先選擇吸收，達到治療作用[3]。

現(xiàn)代Q開關(guān)激光治療色素性病變時，激光脈寬極短，短至幾～幾百納秒（1ns＝10-9s），而峰值功率相當高。可使色素顆粒驟然受熱而發(fā)生瞬間爆破，色素顆粒驟然受熱而發(fā)生瞬間爆破，使色素團或色素細胞破壞、分解，從而達到治療色素斑的效果。由于激光的脈寬小于色素顆粒的熱弛豫時間，因此治療中不會損傷周圍正常組織，細胞框架可被完整地保留下來。而被清除了色素顆粒的細胞，可在較完整的細胞框架的基礎(chǔ)上，得到修復[4]。

但是強脈沖光的脈寬比較長，為幾～幾百毫秒（1ms＝10-3s）連續(xù)可調(diào)，已經(jīng)超過了色素顆粒的熱弛豫時間，治療中可能影響周圍正常組織。但是，強脈沖光峰值功率相對要低，而且能量分布在不同波長的光中，所以可以改善包括不規(guī)則色沉、皮膚紋理和毛細血管擴張在內(nèi)的所有的光老化現(xiàn)象，達到嫩膚的治療目的。且每次擊發(fā)可選擇1～3個脈沖，脈沖方式釋放能量可使靶組織持續(xù)升溫，而讓表皮充分散熱，以保證安全，因而無副作用比較小。

強脈沖光對于皮膚組織的作用與透射深度和組織顏色有一定的關(guān)系。決定透射深度的主要是波長，脈寬和能量與光的透射深度無關(guān)，但會影響能量分布。

實驗中，我們無論從大體標本觀察皮膚色素改變，以及光鏡、電鏡微觀觀察皮膚黑色顆粒的變化，并作統(tǒng)計學比較，均發(fā)現(xiàn)脈寬46.2ms（能量34J/cm2）組去除色素效果優(yōu)于另外兩組。但三組的作用深度基本一致，未見真皮層色素的變化。能量越大在被黑色顆粒吸收后，其轉(zhuǎn)型為熱能就越多，使導致黑色顆粒發(fā)生的“選擇性熱解作用”的機率就越大，從而導致了較好的去除色素的效果。可以認為在安全的前提下，劑量越大，效果越明顯[5]。

但在實驗中我們也觀察到，在能量加大的同時，周圍正常組織受到損傷的機率亦會加大。脈寬46.2ms（能量34J/cm2）組中個別未被及照射的黑素顆粒出現(xiàn)空泡化，但電鏡中觀察其線粒體及高爾基體等細胞器未見變性。這主要是因為照射部位冷凝膠起到了保護的作用。在脈寬36.5ms（能量28J/cm2）、脈寬39.8ms（能量30J/cm2）組中未見相類似的變化，周圍未被照射區(qū)在照射前后無明顯直觀及光鏡、電鏡下變化。究其原因主要是光能量在組織內(nèi)聚集越大，損傷就越大[6]。

實驗中可見隨著照射次數(shù)的增加，豚鼠膚色的逐漸變淺，相同能量對同一照射區(qū)的作用效果逐漸變小，所以可以推測深色皮膚吸收光的能量明顯優(yōu)于淺色皮膚。因此我們在正式治療前應在耳前區(qū)進行光斑試驗，確定治療需要的最佳能量，并且隨著治療次數(shù)的增加應適當提高能量[7]。

強脈沖光對色素產(chǎn)生熱效應，同時也對病灶周圍的其它組織產(chǎn)生熱效應。特別是用高能量治療時對周圍組織損傷的機率加大。所以，在照射前要在照射部位皮膚上涂冷凝膠[8]，這樣可以降低皮膚溫度，從而對周圍正常組織的熱損傷可以降到最低。

在脈沖能量不變時，峰值功率和平均功率與脈寬成反比。因此脈寬愈短，強脈沖光對組織作用的峰值功率就愈強，對組織的損傷愈大。調(diào)長脈寬，就可以降低峰值功率，使能量釋放的時間加長，避免組織局部能量迅速積聚，減少副作用，增加安全性[9]。

而紫色蘭朵達到最高能量時其脈寬同時加大，因此對組織的損傷大大降。但是在實際工作中我們發(fā)現(xiàn)，其參數(shù)可能是針對歐美白人設(shè)置的，對于黃種人仍然顯得偏高。所以現(xiàn)在新的強脈沖光設(shè)備一般都是能量與脈寬隨意可調(diào)了，便于根據(jù)患者情況具體調(diào)整。

[參考文獻]

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[7]Coriene Hannapel.Full-face intense pulsed light treatment battles photoaging [J]. Cosmatic surgery Times， 2000，3(6):252.

[8]Negishi K，Wakamatsu S，Kushikata N，et al.Full-face phtorejurenation of photodamaged by intense pulsed light with tegrated contacr cooling: initial experiences in Asian patients [J]. Lasers Surg Med， 2002，30(4):298.

[9]Coriene Hannapel.Full-Face intense pulsed light treatment battles photoaging[J]. Cosmetic Surgery Times，2000，3(6):252.

[收稿日期]2007-11-21 [修回日期]2008-03-02

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文。”