Ｍｓｘ１編碼區突變與非綜合性唇腭裂相關性分析

[摘要]目的：探討核心家庭中Msx1編碼區突變與非綜合征性唇腭裂的關系。方法：運用測序技術檢測華東地區核心家庭的Msx1基因全部編碼區的突變情況，預測其編碼氨基酸的突變頻率，比較突變位點在患兒與正常兒童中的分布差異并判斷是否有統計學意義，比較患者組與父母組的基因型和等位基因頻率，并對核心家庭的數據進行單倍型相對風險分析(HRR)，對含雜合子父母的核心家庭進行傳遞不平衡檢驗(TDT)。結果：Msx1編碼區序列共有三個位點突變，分別為編碼區1的C101G（A34G）突變，編碼區1同義突變 C330T（G110G），編碼區2 的G162A（S278N）突變。其中只有編碼區1的同義突變C330T（G110G）在患兒與正常兒童中的分布差異有統計學意義，患者與其父母各位點基因型和等位基因分布差異無統計學意義(P＞0.05)，HRR結果和TDT結果無統計學意義，另外兩個突變位點各項統計均無統計學意義。結論：編碼區1的同義突變C330T（G110G）可能與中國華東人群非綜合征性唇腭裂存在相關性，而編碼區1的C101G（A34G）突變和編碼區2 的G162A（S278N）突變與中國華東人群非綜合征性唇腭裂不存在相關性。

[關鍵詞]非綜合征型唇腭裂；Msx1；編碼區；突變；測序

[中圖分類號]R782.2[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-04

Association of mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate by DNA sequencing technology

WU Xuan1，CUN Min-gui2，ZHOU Xiao-ping2，LIU Jia-yin2，WAN Wei-dong1

(1.Department of Plastic Surgery，Zhongda Hospital，Southeast University， Nanjing 210009， China;2.The Center of Clinical Reproductive Medicine， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029，Jiangsu， China)

Abstract:ObjectiveTo explore the relationship between mutations in coding regions of Msx1 and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)in nuclear families consisting of fathers， mothers and affected offspring with NSCL/P from southeast China.MethodsAll mutations in coding regions of Msx1 were detected by applying sequencing technology in nuclear families， predicting mutation frequency of amino acid， comparing the distributional difference of affected offspring and unimpaired child and judge that if it has the statistical significance.Then compare the genetype and allele frequency in affected offspring and fathers. Haplotype Relative Risk (HRR) and Transmission Disequilibrium Test (TDT) were performed.ResultsThere were three mutational sites in all ，mutation C101G（A34G）and samesense mutation C330T（G110G）in coding region1， mutation G162A（S278N）in coding region2. Only samesense mutation C330T（G110G）in coding region1 has significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and normal.No significant difference in genotypes and alleles distribution between patients and their parents.were found. They all got negative results in both HRR and TDT analysis.The other two mutational sites had no significant results in all above.ConclusionThere may have some relationship between Samesense mutation C330T（G110G）in coding region1and NSCL/P in population from southeast China but mutation C101G（A34G）in coding region1and mutation G162A（S278N）in coding region2 have no significant relationship in population from southeast China.

Key words:nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate(NSCL/P); Msx1 gene; coding regions; mutation; sequencing

先天性唇腭裂是人類最常見的先天性畸形之一，國內外研究認為非綜合征性唇腭裂的發病與多基因遺傳、環境及兩者的相互作用相關，目前已選出多個候選基因，Msx1就是其中的一個。因地區環境和種族差異的影響，這個基因在不同文獻的結果不盡一致。Msx1全基因序列總共只有兩個編碼區（本文中命名為編碼區1和編碼區2），本項研究擬采用測序技術在華東地區人群中檢測此基因全部編碼區的突變情況，預測其編碼氨基酸的改變，進一步探討這個基因與NSCL/P的關系。

1材料和方法

1.1對象：共有50個核心家庭和50個正常對照，患兒為經整形外科醫師確診的非綜合征性唇腭裂（NSCL/P）患者，均已排除了綜合征性唇腭裂如Van Der Woude綜合征、Meckel綜合征、歌舞伎面譜綜合征、腭心面綜合征。核心家庭患者年齡分布為1～14歲，平均2.96歲，其中單純唇裂男女患者各有10例和5例，唇裂伴腭裂的男女患者各有24例和11例。患者及其父母來自東南大學附屬中大醫院、江蘇省人民醫院和南京市兒童醫院的住院病人，研究對象均為華東地區漢族人，且均對本項研究簽署了知情同意書。

1.2 DNA提取：按PUREGENE DNA 純化試劑盒的說明書 （美國GENTRA公司）抽提外周血白細胞基因組DNA。

1.3 PCR擴增：參照NCBI 基因庫公布的Msx1基因序列設計擴增引物， 引物均由上海英駿生物公司合成，編碼區1擴增選用大連寶生物公司的LA Tag高保真酶，編碼區2擴增采用南京天為公司pfu高保真taq酶。擴增引物由Primer Primer 5.0軟件設計。編碼區1上游引物(5'-3') 為tggccagtgctgcggcagaa，下游引物(5'-3') 為gttccagacctcctcgcctt，擴增片段長度為701bp；編碼區2上游引物(5'-3') 為tgtggacatcgagccttcaa，下游引物(5'-3') 為cactctccgaagtctgatcc，擴增片段長度為877bp。編碼區1 GC含量高達73.5％，加入GC Buffer可以降低解鏈的難度，提高PCR效率，其反應體系為LA Taq 0.3μl，2×GC Buffer25μl，DNTP 8μl，Primer F1μl，Primer R 1μl，DNA模版1μl，加去離子水至50μl；反應條件為94℃1 min，94℃30s、60℃30s、72℃2 min計30個循環，72℃10 min。編碼區2反應體系為2×master mix 25μl，Primer F2μl， Primer R 2μl， DNA模版1μl，加去離子水至50μl；反應條件為94℃3 min，94℃30s、55℃30s、72℃1min計30個循環，72℃5min。

1.4 純化測序：編碼區1GC含量高達73.5％，純化測序由上海英駿公司完成。編碼區2GC含量57％，由上海博亞公司完成。對發現陽性結果的核心家庭進行重復測序，以檢測測序結果的可靠性，若兩次結果不一致，再進行雙向測序，保證測序結果的可信度。編碼區1正向測序引物為tggccagtgctgcggcagaa，反向測序引物為tggtcctcgggagcccag；編碼區2正向測序引物為tcatgctccaatgcttctct，反向測序引物為cccatgtcgtggtcccga，測序引物由測序公司設計和合成。

1.5 測序結果判讀：用Chromas軟件對測序鋒圖進行分析，判斷雜合子和純合子，從而得到核心家庭的基因序列，用Dnastar軟件對核心家庭的基因序列與Pubmed提供的正常序列進行比對，以發現突變位點。

1.6 統計學分析：患兒組與對照組做病例對照研究的卡方檢驗；患兒組與父母組基因型分別做Hardy-Weinberg平衡檢驗。對核心家庭的父母及患者做各位點基因型及等位基因頻數比較，和單體型相對風險分析（Haplotype Relative Risk， HRR）。選取親代至少有一位是雜合子的核心家庭作傳遞不平衡檢驗（transmission disequilibrium test， TDT）。統計由Stata9軟件完成。

2結果

2.1 PCR產物凝膠電泳：編碼區1PCR產物長度為701bp，PCR產物凝膠電泳圖如圖1，編碼區2 PCR產物長度為877bp，PCR產物的凝膠電泳如圖2。

2.2測序結果

2.2.1編碼區1：圖3是一患兒的部分測序峰圖，圖上可見第115號位點是個雙峰，該位點為雜合子，基因型為G/C雜合型，而該位點對應的是編碼區1的101號位點，即該患者編碼區1的101號位點為G/C雜合型。圖4上可見343號位點也是個雙峰，為雜合子，基因型為T/C雜合型，而該位點對應的是編碼區1的330號位點，即該患者編碼區1的330號位點為T/G雜合型。圖5上可見該患者第115號位點和344號位點都為雙峰，分別對應為編碼區1的101號位點和330號位點，說明該患者此兩個位點的突變是連鎖性突變。

2.2.2編碼區2：編碼區2在父母中未發現突變的基因型，在一例患兒中發現有G162A突變。

2.3 患兒與正常人基因型差異的卡方檢驗：①表1所示為101位點患兒與正常對照得基因型分布，代入卡方檢驗公式，得卡方值χ2=0.92，對應P值＞0.05，無統計學意義；②表2所示330位點患兒與正常對照組的基因型分布，代入卡方檢驗公式，其中T=6×50/100=3，1＜T＜5，n=100＞40，用計算校正的卡方值，計算得χ2=4.43，對應P值＜0.05，有統計學意義。

2.4患兒組與父母組各位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），各位點兩組間基因型及等位基因頻數皆無統計學差異，見表3與表4

2.5 HRR分析：C101G與C330T兩位點各自兩個等位基因在傳遞與未傳遞例數比較中差異無統計學意義，P＞0.05。見表5。

2.6 TDT結果：各位點以患者染色體等位基因為病例組，患者父母未傳遞給患者的等位基因為內對照，進行病例內對照研究，經檢驗，此兩位點P值均＞0.05，無統計學意義，見表6。

2.7 編碼氨基酸突變：Msx1基因一共只有兩個編碼區，即編碼區1和編碼區2，通過以上編碼區基因的突變，我們可以得出Msx1編碼的氨基酸序列的變化，但由于突變率較低，都沒有統計學意義。見表7。

3討論

非綜合征性唇腭裂是一種常見的先天性顏面部缺陷，世界各地發病率從1/500到1/2500不等，目前被認為是多基因遺傳病。Msx1是最近研究的熱點之一。

Msx1基因是同源異型盒基因家族的成員之一，它作為核轉錄因子，是器官發育過程中的主調控基因，亦是頜面發育的重要轉錄因子，其基因突變可導致唇裂、腭裂等嚴重先天性畸形。Msx1編碼區的exon1編碼150個氨基酸，exon2編碼147個氨基酸，編碼區多態性致氨基酸變異大多集中在exon1。Jezewski[1]等對Msx1進行測序分析時發現的氨基酸突變有， E78V，G98E，G110GV，114G，G116E，L118L。同時證實同義突變G110G（c＞t）在亞洲人群的非綜合性唇腭裂中有顯著意義。缺失突變（811－816缺失）在Iowa州人群中與非綜合性唇腭裂的關聯性亦被發現，具有統計學意義。Yasushi Suzuki[2]等在對一組越南NSCL/P核心家庭研究時發現Msx1基因中兩種錯義突變，P147Q和G98E。其中P147Q，即該基因的第一個外顯子第440個堿基由C變為A，此人群中2%的患者有這種點突變，有統計學意義。Tongkobpetch S[3]等對100名泰國非綜合性唇腭裂患者的Msx1編碼區進行分析，在外顯子2編碼區的羧基末端新發現了兩個突變G267C，P278S，而在162名對照組中沒有發現此兩種突變。Jungyong Park[4]等以52名韓國非綜合性唇腭裂患者為對象，對Msx1基因內部及其周圍9.8kb長度的序列進行了測序分析，結果發現了7個snp位點，其中位于exon2的第7個SNP，1170G/A在韓國非綜合性唇腭裂人群中有著顯著意義。Vieira[5]等對智利45個NSCLP家系進行研究，發現MsxI基因兩個錯義突變(G16D和G34A)， G16D突變可能破壞了一個剪接位點，導致唇腭裂的形成。De Muynck[6]等研究發現，在一個唇聘裂家系的3個個體中發現一個新的MsxI突變，C559T，導致編碼氨基酸由谷氨酸轉變成終止信號。

本研究采用傳統的病例對照設計和核心家庭的病例父母對照研究，進行了 HRR分析和TDT檢驗，以患者父母為內對照，可避免關聯研究中存在的不恰當的對照問題。其中TDT不受遺傳方式、群體不純、分層的限制而成為研究核心家庭遺傳標志與疾病易感位點關系的首選方法。本實驗的結果表明，編碼區1的同義突變G110G（C330T）有統計學意義，與Jezewski等在亞洲人群中的研究結果一致，證實其在中國華東人群非綜合征性唇腭裂中存在一定相關性。A34G（C101G）的突變在Vieira等對智利45個NSCLP家系的研究中也發現了，但在本實驗研究的中國華東人群非綜合征性唇腭裂中無統計學意義。編碼區2的G162A（S278N）突變在本實驗研究對象中只發現了一例，無統計學意義。我們的研究結果與國內外同類報道不盡一致，可能主要與基因存在種族和地區的差異性相關。

Msx1編碼由297個氨基酸組成的蛋白質。人類連鎖和連鎖不平衡研究發現， Msx基因特殊編碼序列的突變，可能會使Msx編碼蛋白缺失，從而引起其功能不足，導致遠端面芽萌出缺乏，隨之發生一期或二期腭裂[7]。突變Msx1蛋白缺乏N端結構域，無法調節細胞周期素(cyclin D1)，故抑制分化[8]。對Msx1基因編碼的轉錄因子如何調節細胞內信號級聯反應并介導誘導組織間相互作用，下位靶基因及其對器官發生中相關細胞過程的確切作用機制等方面的進一步研究，將為闡明疾病的分子生物學機制，以及臨床開展非綜合性唇腭裂患者的產前診斷、早期基因修正、孕期外源性生長因子治療等研究，奠定理論基礎，為患病人群及后代提供預警和遺傳風險的評估和咨詢，據此建立有效的預防和干預措施。

[參考文獻]

[1]JezewskiP A，VieiraA R，NishimuraC，et al. Completes equencing shows a role for MSXI in non-syndromic cleftlip and palate[J].Med Gene，2003，40:399-407.

[2]Suzuki Y， Jezewski PA， Machida J， et al. In a Vietnamese population， Msx1 variants contribute to cleftlip and palate[J]. Genet Med，2004，6:117-125.

[3]Tongkobpetch S， Siriwan P， Shotelersuk V. Msx1 mutations contribute to nonsyndromic cleft lip in a Thai population[J]. J Hum Genet，2006，51(8):671-676.

[4]Park J， Park BY， Kim HS，et al.Msx1 Polymorphism Associated with Risk of Oral Cleft in Korea: Evidence From Case-Parent Trio and Case-Control Studies[J].Yonsei Med J， 2007，48 (1):101-108.

[5]Vieira AR，Castillo TS，Aravena T，et al.Mutationala nalysis of the muscles egment homeoboxg ene1 (Msx1)inC hileanp atients with cleft lip/palate[J].Rev Med Chil，2004，132:816-822.

[6]De Muynck S，Schotlen E，Matthjs G，et al.A novel Msx1 mutation in h- ypodontia[J]. Am J Med Genet A，2004，128:401-403.

[7]Satokata I， MaasR. Msx1deficientmice exhibitcleftpalate and abnormalities of craniofacial and tooth development[J]. NatGenet， 1994，6:348-356.

[8]Hu G，LeeH，Price SM，et al. Msx homeobox genes inhibit differentiation through upregulation of cyclin D1[J]. Development， 2001，128:237-238.

[收稿日期]2007-12-09[修回日期]2008-03-06

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”