瘢痕疙瘩發病風險與Ｆａｓ基因－６７０位點多態性

[摘要]目的：研究Fas基因-670位點多態性與瘢痕疙瘩發病風險的關系。方法：采用聚合酶鏈反應-反向點雜交、DNA直接測序方法，檢測了75例瘢痕疙瘩患者與120名正常對照的Fas基因-670多態性位點的基因型。結果：瘢痕疙瘩患者的A等位基因頻率明顯高于正常對照組(χ2=4.408，P=0.036)。瘢痕疙瘩患者的A/G、G/G基因型頻率與正常對照組相比差異無統計學意義(χ2值分別為1.051和1.134;P值分別為0.305和0.287)，而瘢痕疙瘩患者的A/A基因型頻率明顯高于對照組(χ2=5.207，P=0.022)。提示A/A基因型者患瘢痕疙瘩的風險性明顯高于A/G、G/G基因型者(OR=2.122，95%CI:1.105～4.077)。結論：Fas基因-670多態性位點的基因型檢測可能對判斷瘢痕疙瘩高危個體具有指導意義。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩；Fas基因；多態性；遺傳易感性

[中圖分類號]R619+.9[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-03

Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population

ZHUO Yang，ZENG Xing-ye， ZHOU Xue-xue，HUANG Da-dao，CAO Xiao-en，HUANG Zheng-lian

（Department of Surgery，the 118th Hospital of PLA，Wenzhou 325000，Zhejiang， China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 unrelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408，P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287， respectively). However， the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207，P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid，compared to the combination of A/G and G/G genotypes，with the odds ratio(OR) of 2.122， (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.

Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility

近幾年的研究結果提示，瘢痕疙瘩成纖維細胞的過量增生和凋亡相對減少在瘢痕疙瘩的發生、發展中起著重要作用[1]。而Fas蛋白是細胞表面一種與凋亡相關的抗原，Fas介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。為此，我們從分子遺傳學角度，探討Fas基因-670位點多態性與浙江地區漢族人群瘢痕疙瘩發病風險的關系， 以便深入地、多層次地解析瘢痕疙瘩的分子生物學機制。

1對象和方法

1.1 研究對象：瘢痕疙瘩患者和正常對照人群均為浙江地區漢族居民。瘢痕疙瘩患者均經本院臨床及病理診斷證實，共75例，其中男41例、女34例，年齡9～53歲，病變位于前胸、三角肌區及耳垂，病史6個月～15年。正常對照為有外傷史而無瘢痕疙瘩產生，且無瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例，年齡13～60歲，平均年齡29.6歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃保存備用。

1.2聚合酶鏈反應-反向點雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提取：采用北京賽百勝生物技術有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設計：應用Primer Premier5.0設計探針，氨基標記，探針序列分別為：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應：用于擴增Fas基因-670位點的引物5′端標記了非同位素檢測介質Biotin，引物序列為：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反應在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應總體積中，含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環參數：95℃熱啟動2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35個循環 72℃延伸 10min。取3μl擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察結果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉入20ml顯色液[19ml 0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/ml TMB]中避光顯色5～15min，期間觀察、記錄結果。

1.3 為檢驗反向點雜交結果的正確性，隨機抽取18例PCR擴增產物送上海生工生物公司測序。

1.4 統計學處理：應用SPSS10.0統計軟件包處理數據，采用χ2檢驗分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計算表示相對風險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidenceinterval，CI)。

2結果

根據我們設計的方案，雜交結束后膜條上格顯示藍紫色斑點為A/A基因型，中格顯示藍紫色斑點為G/G基因型，而上、中全部顯示為A/G基因型，下格為空白對照，無斑點顯示（圖1）。瘢痕疙瘩組和正常對照組Fas基因多態性比較如表1、2所示。

實驗中，在瘢痕疙瘩和正常對照組間的年齡構成比例相似，對照組及瘢痕疙瘩患者組的Fas-670位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情況下，結果顯示：①瘢痕疙瘩組的A等位基因頻率(54.7%)明顯高于正常對照組(43.8%)(χ2=4.408，P=0.036，P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型頻率分別為40.0%和25.3%， 與正常對照組相比差異無顯著性 (χ2值分別為1.051和1.134； P值分別為0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩組的A/A 基因型頻率為34.7%，明顯高于正常對照組(χ2=5.207，P=0.022，P＜0.05)。與A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相對風險性(OR)明顯增高(OR=2.122，95%CI: 1.105～4.077)。我們隨機抽取的18例PCR擴增產物測序結果與反向點雜交結果完全吻合（圖2），證明了聚合酶鏈反應-反向點雜交結果的正確性。

3討論

近年來，遺傳因素在許多疾病的發生中所起的重要作用備受重視，且已發現了多種易感基因的存在。Fas基因即是目前較為關注的與瘢痕疙瘩疾病相關的基因之一。人Fas基因組DNA位于染色體10q24上，是全長36Kb的單拷貝基因，由8個內含子及9個外顯子組成，編碼335個氨基酸，其全稱是factor associated suicide，又稱CD95/APO-1，屬于NGF/TNF受體家族，其相應的配體及單克隆抗體與之結合后可誘導細胞凋亡。Fas蛋白包括膜外區、跨膜區和膜內區，Fas蛋白的重要功能結構“死亡域”編碼區位于膜內區[2]。已證實FasR-FasL系統在調控細胞增殖和凋亡中起著重要的作用[3-4]，Fas介導的凋亡被認為是介導死亡信號傳遞的最主要通道。

Fas 基因啟動子區域存在兩個多態性位點[5]，其啟動子-670 核苷酸APG多態性位點位于核轉錄元件GAS 中，能影響干擾素的信號傳導。干擾素與其受體結合后，激發了酪氨酸激酶Jak(janus kinases)，使轉錄信號傳導和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1，STAT1) 酪氨酸磷酸化，磷酸化的STAT1 形成同源二聚體與GAS元件結合，誘導含有GAS元件的基因轉錄[6]。當然其他細胞因子與其受體結合后，也可通過STAT家族成員誘導含有GAS元件的基因轉錄[7]。若Fas-670 位點堿基為G，則含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位點) ，該序列能被STAT家族的多數成員識別[8]，細胞因子-受體作用激活STATs，從而誘導Fas基因轉錄。而堿基A代替G后，則DNA序列變為TTCNNNAAA，可能影響Fas轉錄，影響Fas蛋白表達。已有報道其他基因GAS元件能夠影響轉錄水平[9]。

國外對Fas-670位點多態性與自身免疫性疾病相關性研究，提示AA 基因型與白種人類風濕性關節炎的臨床亞型相關[10]，系統性紅斑狼瘡、多發性硬化患者A等位基因頻率顯著增高[9-10]。然而，國內外尚未見Fas 基因多態性與瘢痕疙瘩的相關性研究。本研究初步結果提示，Fas基因-670位點A等位基因及AA基因型是中國浙江地區人群對瘢痕疙瘩的易感因素。我們的初步研究結果對瘢痕疙瘩的預測診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實驗采用的聚合酶鏈反應-反向點雜交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之，即反方向的將各種探針固定在基質上，用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。近年來應用此法進行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術簡便、快速、可靠，其檢測結果與DNA測序符合率高，值得推廣應用。

[參考文獻]

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[收稿日期]2007-11-26 [修回日期]2008-02-27

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”