ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信號通路在ＣＴＧＦ促人增生性瘢痕成纖維細胞轉分化中的作用

[摘要]目的：探討磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路是否介導結締組織生長因子促人增生性瘢痕成纖維細胞轉分化。方法：體外培養人增生性瘢痕成纖維細胞，實驗分3組：①空白對照組；②結締組織生長因子（10ng/ml）刺激組；③磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預處理后結締組織生長因子刺激組。應用免疫印跡技術檢測48h后a-平滑肌肌動蛋白的表達，應用流式細胞術檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率。 結果：和空白對照組相比，結締組織生長因子刺激組細胞a-平滑肌肌動蛋白表達和陽性細胞百分率升高；經磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002預處理后，再以結締組織生長因子刺激，細胞a-平滑肌肌動蛋白表達和陽性細胞百分率升高水平下降，經統計學分析，差別具有顯著性（P＜0.05）。 結論：結締組織生長因子能夠促進人增生性瘢痕成纖維細胞轉分化，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路介導該效應，磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002 可抑制此效應。

[關鍵詞]結締組織生長因子；增生性瘢痕；成纖維細胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；轉分化；a-平滑肌肌動蛋白

[中圖分類號]R619+.9[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）03-

Effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B( PI3K/PKB) signal pathway

LIU Jian-yi，LI Shi-rong

（Department of Plastic and Cosmetic Surgery， Southwest Hospital， the Third Military Medical University， Chongqing， 400038， China）

Abstract： ObjectiveTo explore if the effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B(PI3K/PKB) signal pathway. MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro. The cells were divided into three groups: ①control group，②connective tissue growth factor（10 ng/ml）stimulated group，③PI3K inhibitor LY294002（10μmol/ L）pretreated and connective tissue growth factorstimulated group. The expression of a-smooth muscle actin was examined by western blot in human hypertrophic scar fibroblasts after 48 hours. The positive ratio of a-smooth muscle actin was examined by flow cytometry.ResultsCompared with the control group， the expression and the positive ratio of a-smooth muscle actin in the connective tissue growth factor stimulated group increased. The raise level of a-smooth muscle decreased after the pretreatment of PI3K inhibitor LY294002. The results were markedly different by statistic analysis（P<0.05）.ConclusionConnective tissue growth factor can promote the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by PI3K/PKB signaling pathway. This effect can be inhibited by LY294002.

Key words: connective tissue growth factor; hypertrophic scar; fibroblast; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; transdifferentation; a-smooth muscle actin

增生性瘢痕（hypertrophic Scar，HS）是人類皮膚真皮損傷后以成纖維細胞過度增殖和細胞外基質如膠原等過度沉積為特征的皮膚纖維化疾病，其中成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞后促纖維化功能明顯增強。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一種具有強烈促纖維化作用的生長因子，具有促進成纖維細胞轉分化的作用[1]。磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路（PI3K /PKB）參與CTGF促HS纖維化（另文發表），但是否介導促轉分化效應，尚未見報道。本研究擬應用CTGF刺激人增生性瘢痕成纖維細胞（hypertrophic Scar fibroblast，HSF），檢測細胞a-平滑肌肌動蛋白的表達，并應用PI3K抑制劑LY294002 進行阻斷，以初步明確PI3K /PKB信號通路在其中的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑：人重組CTGF購自美國peprotech公司。小鼠抗人a-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體和FITC標記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司產品。PI3K特異性抑制劑LY294002、辣根過氧化物酶連接的“二抗”、生物素化的蛋白相對分子質量標準及其抗體以及化學發光試劑均購自美國Cell Signaling Technology公司。預染的蛋白相對分子質量標準購自美國Promega 公司。DMEM培養基和新生小牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：實驗所用HS組織取自我科因HS自愿行手術治療的患者，均為創面愈合3個月以上瘢痕仍持續增生者，術前均取得患者同意，所取HS特點為外觀發紅、充血、質硬、高出皮面1cm以上，瘢痕增生局限于皮損區，局部伴瘙癢或疼痛等不適，共6例，其中男性4例，女性2例，年齡21～40歲，平均29.2歲。用酶消化法分離成纖維細胞，于37 ℃，CO2體積百分數5%的孵箱中培養，傳代，實驗用第5～7代細胞，用0.25%胰酶消化后，將細胞以8×105/瓶接種于75cm2培養瓶中，先用10% FBS－DMEM培養基培養12h，待細胞達到60%～70%融合后，用無血清培養基培養24h，使細胞達到同步，棄去培養基。實驗分3組：①空白對照組；②結締組織生長因子（10ng/ml）刺激組；③磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預處理后結締組織生長因子刺激組（先用10μmol/L LY294002 作用細胞60min，再與10ng/ml CTGF共同作用細胞30min）。

1.2.2 western blot法檢測a-平滑肌肌動蛋白表達：采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 和免疫印跡雜交法。①藥物作用：以10ng/ml CTGF作用HSF 48h；②細胞總蛋白的提取：棄去藥物，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS) 沖洗細胞，立即加入1×SDS 上樣緩沖液（含62.5 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸，2% SDS，10%甘油，50mmol/L 二硫蘇糖醇，0.01%溴酚藍），迅速刮下細胞，冰上裂解，冰上細胞超聲15～20s，離心，取上清液于-70℃保存；③ SDS-PAGE和免疫印跡雜交：各取20μl 細胞裂解提取物，95℃變性5min，上樣，進行電泳、轉膜、洗膜后封閉，加入小鼠抗人a-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，洗膜，加入二抗室溫下作用1h，洗膜后加化學發光液，X線片曝光，對蛋白條帶進行吸光度(A) 值測定。內參照采用GAPDH。蛋白含量以a-平滑肌肌動蛋白和內參蛋白的平均光密度(OD)×面積(mm2)的比值來表示。

1.2.3 流式細胞術檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率：制備細胞懸液，收集各組細胞(細胞培養于75cm2培養瓶中)；PBS漂洗細胞兩次后，離心，得到細胞沉淀；4％多聚甲醛固定30min，離心，棄上清；用0.1％皂素(內含2%BSA)通透10min，以利于抗體進入胞內，離心，棄上清；加入鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(1:100)300μl，室溫孵育1h；PBS洗滌兩次后，加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育30 min；PBS洗滌兩次后，重懸于300μl PBS溶液中，行FCM檢測。

1.3. 統計學方法：實驗重復3次，結果以x±s表示，應用SPSS10.0 軟件進行數據統計。組間比較應用方差分析，P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1 a-平滑肌肌動蛋白表達情況：空白對照組有較少量的a-平滑肌肌動蛋白表達，當外源重組結締組織生長因子刺激后，a-平滑肌肌動蛋白表達，而當應用磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預處理后再刺激，a-平滑肌肌動蛋白表達升高較少，統計學分析，差別具有顯著性（P＜0.05），結果見圖1、表1。

2.2 a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率：應用流式細胞術檢測a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率。和空白對照組相比，10ng/ml 結締組織生長因子刺激組細胞a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率升高，統計學分析，差別具有顯著性（P＜0.05）；經磷脂酰肌醇3激酶抑制劑LY294002（10μmol/L）預處理后，再以結締組織生長因子刺激，a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率升高較少，和單純刺激組相比，統計學分析，差別具有顯著性（P＜0.05）。空白對照組和LY294002預處理后結締組織生長因子刺激組相比較，無統計學差異（P＞0.05）結果見表2。

3討論

HS是整形外科領域重點研究內容之一，其發生、發展主要是由成纖維細胞、細胞外基質和生長因子三者共同的作用導致，而抑制成纖維細胞的增殖和分化是抗纖維化的中心策略，生長因子在其中起極其重要的調控作用。在創面愈合瘢痕形成過程中，曾處于靜止狀態的成纖維細胞增殖并分化，其中70%左右的成纖維細胞分化為收縮表型，被稱為肌成纖維細胞。它是介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間的終末分化細胞，能夠分泌大量的膠原和纖維連接蛋白，使細胞外基質沉積，a-平滑肌肌動蛋白是其標志性蛋白[2]。

CTGF是一種新發現的在纖維化病程中發揮重要促進作用的生長因子[3]，我們前期研究表明它具有促進成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞的作用[1]，但傳遞此效應的的具體細胞內信號通路還不清楚。PI3K/PKB是近年來發現的一個新的生長因子信號轉導途徑。PI3K是一種重要的細胞內蛋白激酶，當細胞受生長因子等刺激因子刺激后，細胞內PI3K活化，使其轉化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），并與其下游分子Akt 結合，活化的PI3K/Akt 可能通過TSC1/2 復合物進一步激活其中下游分子Mtor、eIF- 4E 結合蛋白1（4E- BP1）和核糖體蛋白P70S6K，啟動蛋白質的翻譯，因此磷酸化的PI3K被認為是蛋白質合成的主要信號調節通路，參與細胞增生、分化、移行等的調節[4-5]。在人腎系膜細胞中，PKB信號通路在CTGF誘導、細胞外基質沉積，細胞遷移和細胞骨架重排中起作用[6]。亦有研究表明PI3K/PKB通路參與轉化生長因子-β1誘導人腎小管上皮細胞間質轉分化過程[7]。

我們前期研究結果表明PI3K/PKB信號通路參與CTGF促HS纖維化（另文發表），其是否介導CTGF促成纖維細胞轉分化？我們應用了PI3K特異性抑制劑LY294002預處理HSF，再以CTGF刺激，結果表明阻斷后細胞a-平滑肌肌動蛋白表達較單純刺激組下降，同時流式細胞術分析a-平滑肌肌動蛋白陽性細胞百分率亦下降，這說明LY294002阻斷了PI3K/PKB信號通路，導致了a-平滑肌肌動蛋白整體水平下降，外源性CTGF不能通過PI3K/PKB信號通路產生促成纖維細胞轉分化的效應，亦即PI3K/PKB信號通路介導了CTGF促成纖維細胞向肌成纖維細胞分化的效應。但該信號通路效應對應的細胞核內靶信號分子仍有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]李 喆，李世榮，劉劍毅，等.結締組織生長因子體外促進人增生性瘢痕成纖維細胞轉分化的研究[J].第三軍醫大學學報，2006，28（8）：775-777.

[2]Shin D， Minn KW.The effect of myofibroblast on contracture of hypertrophic scar[J].Plast Reconstr Surg， 2004，113(2):633-640.

[3]劉劍毅，李世榮，紀淑興.病理性瘢痕中結締組織生長因子基因的表達[J]. 中國修復重建外科雜志， 2003， 17 (6):436-438.

[4]Xu G， Zhang W， Betram P， et al. Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN- AKT- mTOR pathway in common human tumors[J]. Int J Oncol，2004，24(4):893-900.

[5]Gao N， Zhang Z， Jiang BH， et al. Role of PI3K/AKT/mTOR signaling in the cell cycle progression of human prostate cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun，2003，310(4):1124-1132.

[6]Crean JK， Finlay D，MurphyM， et al. The role of p42 /44 MAPK and p rotein kinase B in connective tissue growth factor induced extracellularmatrix p rotein p roduction， cell igration， and actin cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells[J]. J Biol Chem， 2002， 277 (46): 44187-44194.

[7]張 勇，張 景.PI3/K的激活在TGF-β1 誘導腎小管上皮細胞間質轉分化過程中的作用[J].解放軍醫學雜志，2006，31（6）：553-555.

[收稿日期]2007-12-25 [修回日期]2008-03-07

編輯/張惠娟

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文。”