同種異體軟骨移植免疫排斥反應(yīng)的研究進展

關(guān)節(jié)炎、顳頜關(guān)節(jié)疾病及關(guān)節(jié)機械損傷以及頜面部美容整形的發(fā)展，都使得軟骨治療成為倍受關(guān)注的對象，由于軟骨組織中無血管、神經(jīng)及淋巴等供應(yīng)，而軟骨細胞又為終末分化細胞，軟骨缺損很難自身修復(fù)，故治療以軟骨移植為主。軟骨移植包括自體、同種異體、異種移植，其中自體軟骨移植來源有限、給患者帶來二次創(chuàng)傷并增加患者疼痛而致應(yīng)用受限，異種移植由于強烈的免疫排斥等問題研究還處在基礎(chǔ)實驗階段，而同種異體軟骨移植來源廣泛，生物學(xué)性能良好，可望成為較理想的軟骨移植物，但其存在的免疫排斥反應(yīng)影響移植物在體內(nèi)的長期存活，是目前研究不容忽視的問題[1]。

1免疫原性來源

1.1軟骨細胞表面的主要組織相容性抗原（MHC）：軟骨細胞同其他有核細胞一樣表面也表達MHC I類分子[2]，供者和受者細胞間MHC分子不匹配所誘發(fā)的細胞和抗體介導(dǎo)的細胞毒反應(yīng)是引起同種異體軟骨移植免疫反應(yīng)的關(guān)鍵[3]。許多學(xué)者在人或豬的軟骨組織實驗研究中表明：軟骨細胞只表達MHC I類分子，而不表達MHC II，但與γ-干擾素（IFN-γ）共培養(yǎng)誘導(dǎo)后可表達MHC II，進而發(fā)揮類似抗原提呈細胞的功能，促進免疫排斥反應(yīng)[4-5]。 Romaniuk等[6]進行了兔同種異體骺軟骨細胞移植研究，發(fā)現(xiàn)1周后移植物周圍有大量MHC II+細胞、CD4+細胞及單核/巨噬細胞浸潤，這可能也是由于MHC I類分子激發(fā)同種異體淋巴細胞活化，分泌IFN-γ進而誘導(dǎo)所致。

1.2軟骨細胞特異性分化抗原（CSDA）：Langer等[7]通過分析白細胞游走試驗發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)同基因軟骨細胞注射或軟骨刨削后可發(fā)生自身反應(yīng)，首次證實了軟骨細胞特異分化抗原(CSDA)的存在。Moskalewski 等[8]在同種異體軟骨移植的大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，間期接受2～3次大鼠軟骨細胞移植的兔血清中含有高滴度的抗軟骨細胞的細胞毒抗體，同時對新鮮或培養(yǎng)24h的軟骨細胞溶胞產(chǎn)物Western blot蛋白分析中檢測到了一種抗原，而在成纖維細胞及內(nèi)皮細胞中未檢測到，表明軟骨細胞特異性抗原在移植免疫中發(fā)揮了重要作用。Phipatanakul等[9]在進行新鮮異體骨軟骨移植的研究中也檢測到移植物軟骨特殊蛋白抗原的存在。

1.3軟骨細胞外基質(zhì)（ECM）：軟骨組織由豐富的細胞外基質(zhì)和少量軟骨細胞組成，ECM將軟骨細胞包裹在軟骨陷窩內(nèi)，隔絕了軟骨細胞與宿主免疫原性分子的相互接觸，形成免疫屏障，預(yù)防或延緩了同種異體軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)[10-11]。軟骨基質(zhì)主要由II型膠原和多聚蛋白聚糖(aggrecan)組成，蛋白多糖中的核心蛋白具有抗原性，但被其周圍無抗原性的酸性糖胺多糖所遮蓋，致使其不具有抗原性[12]，這在提取硫酸軟骨素體外免疫實驗中亦得以證實。對于II型膠原，有學(xué)者研究指出其存在抗原性，且是一種T細胞依賴性的抗原，在軟骨組織工程中應(yīng)考慮其抗原性[13]。但由于II型膠原抗原性非常弱，目前的軟骨異體移植研究中幾乎都未將膠原的抗原性考慮在內(nèi)。

1.4 免疫細胞及相關(guān)組分：自然殺傷細胞（NK）對正常的軟骨細胞具有自發(fā)的細胞毒效應(yīng)，Anna Romaniuk等[8]在大鼠同種異體軟骨移植研究中指出，CD8+是參與移植軟骨直接破壞的重要細胞，而CD8標記物在NK細胞上也有分布，表明NK細胞對移植的軟骨細胞也有殺傷作用。而樹突狀細胞（DC）的抗原提呈作用，單核細胞、巨噬細胞以及少許非主要組織相容性抗原等在軟骨移植中均發(fā)揮了重要作用。

1.5 其他：Osiecka-Iwan等[14]研究使用TLCK和膠原酶處理的軟骨細胞與脾細胞混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示加TLCK處理組并未引起脾細胞的刺激作用，而未加TLCK組卻相反，說明在軟骨分離時所用的II型膠原酶是致免疫源，而該酶在軟骨細胞中的殘留也是軟骨移植免疫反應(yīng)的一個來源。另外，基礎(chǔ)實驗中缺損模型的制備方法以及所選動物的近交程度均對軟骨移植的免疫排斥有影響。

2軟骨免疫反應(yīng)機制

軟骨細胞表達主要組織相容性抗原(MHC)I類分子，有些動物還表達MHC II 類分子，如兔和小鼠[15]。而人和豬只表達I類，受體和供體的MHC分子不匹配所誘導(dǎo)的T細胞介導(dǎo)的細胞毒反應(yīng)是同種異體軟骨移植發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的關(guān)鍵。

軟骨移植免疫反應(yīng)發(fā)生的途徑包括：①CD8+ T細胞即殺傷T細胞(Tc)識別MHC I類分子而引起的對靶細胞的直接殺傷作用；②NK細胞對異體細胞的殺傷作用；③誘導(dǎo)性的MHC II分子-CD4+ T細胞間接識別免疫途徑；④樹突狀細胞(DC)對靶細胞的作用，即抗原提呈作用。而在整個免疫排斥反應(yīng)中淋巴細胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ等發(fā)揮了重要作用。

同種異體軟骨移植后，移植物外周暴露的軟骨細胞上的MHC I分子被受體CD8+T細胞識別，并與其表面受體(TCR)結(jié)合，進而激活Tc細胞，活化的Tc細胞會釋放胞漿內(nèi)顆粒：穿孔素(peiforin)和顆粒酶(granzyme)，前者在靶細胞膜上穿孔，后者是胰蛋白酶或糜蛋白酶類物質(zhì)，它們對靶細胞的殺傷作用很快，使軟骨細胞在數(shù)分鐘內(nèi)迅速被溶解；同時它釋放的效應(yīng)分子可活化靶細胞內(nèi)核酸酶，破壞靶細胞的DNA，從而誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡；另外，活化的Tc還表達配體Fasl，它可與靶細胞上的受體Fas分子（又稱CD95）結(jié)合，促使靶細胞凋亡，而T細胞表面也表達有Fas，故Tc活化后也可殺死自身或相鄰表達Fas的T細胞，即為活化誘導(dǎo)的細胞死亡，此過程對免疫應(yīng)答的負調(diào)節(jié)或維持自身耐受很重要。

Tc細胞活化后還會釋放細胞因子如IFN-γ、TNF-β等。IFN-γ可刺激抗原提呈細胞（APC）表達MHC II類分子，進而被宿主的CD4+T細胞所識別，促進Th1/Th2活化，釋放IL-2等因子，引起更強烈的免疫排斥反應(yīng)。柳子星等[16]將IFN-γ與軟骨細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)軟骨細胞可表達MHC II類分子，使其發(fā)揮類似抗原提呈細胞(APC)功能，這進一步證實了IFN-γ的刺激作用，并說明軟骨細胞移植后還誘導(dǎo)了MHC II類分子表達，從而激活了MHC II分子-CD4+T細胞免疫反應(yīng)途徑。同時IFN-γ還具有增強NK細胞的細胞毒活性，促進CTL成熟等特點。

正常情況下，MHC I類分子和KIR(NK細胞的抑制性受體)相結(jié)合，有效阻止了NK對自身正常組織的攻擊，但KIR不能識別同種異基因或異種細胞的MHC I類分子，故在同種異體軟骨移植中無法轉(zhuǎn)導(dǎo)負向調(diào)節(jié)信號，致使NK細胞處于激活狀態(tài) ，從而殺傷異體軟骨細胞。另外由T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中所釋放的細胞因子如IFN-γ和IL-2均可進一步增強NK細胞的細胞毒活性。

3免疫反應(yīng)的處理

同種異體軟骨移植后有較強的免疫排斥反應(yīng)，為了維持軟骨移植后的穩(wěn)定，目前降低異體軟骨移植免疫排斥反應(yīng)的方法主要有以下幾種：

3.1 MHC分子的配型：Stevenson 等[17]在犬的同種異體軟骨移植實驗中，對軟骨細胞的MHC配型或不配型的對比研究發(fā)現(xiàn)，不配型移植組較配型移植組免疫反應(yīng)嚴重，有學(xué)者主張建立軟骨細胞庫，以便為軟骨移植提供合適的供體。

3.2 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：曹誼林等[18]應(yīng)用FasL-pLNCX2基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染豬的軟骨細胞，使FasL基因轉(zhuǎn)入豬的軟骨細胞中并有效表達，首先在體外證實了FasL+軟骨細胞能有效殺傷Fas靶細胞，應(yīng)用該細胞構(gòu)建的組織工程軟骨進行同種異體移植的進一步研究表明， FasL+軟骨細胞在體內(nèi)可形成軟骨組織，且移植物局部免疫反應(yīng)有所降低，表明該技術(shù)有利于發(fā)揮抑制免疫反應(yīng)的作用。

3.3免疫抑制劑的應(yīng)用：為了克服免疫排斥反應(yīng)，許多學(xué)者還嘗試像器官移植一樣采用免疫抑制劑來處理。Osiecka-Iwan 等[14]在大鼠同種異基因軟骨移植后，應(yīng)用環(huán)孢霉素A和克拉屈濱藥物處理，移植5周后觀察脾細胞－軟骨細胞混合培養(yǎng)中脾單核細胞(SMC)的刺激作用，發(fā)現(xiàn)單純同種異體移植者SMC刺激作用強烈，聯(lián)合應(yīng)用免疫抑制劑者則無刺激作用，表明免疫抑制劑可抑制異體軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)，且對全身反應(yīng)的作用較局部反應(yīng)更為明顯。

3.4 深低溫凍存：深低溫凍存尤其是程序性降溫可明顯地減輕軟骨細胞抗原性，從而預(yù)防性地降低移植后的免疫排斥反應(yīng)[19]，該現(xiàn)象可能的解釋有：①低溫冷凍選擇性去除或減少了過路淋巴細胞，或喪失了對過路淋巴細胞的免疫刺激能力，從而導(dǎo)致了抗原性降低；②深低溫凍存降低了移植軟骨樹突狀細胞的數(shù)量和功能，減少了抗原提呈作用[20]。但該方法會影響細胞的活力，Acosta 等[21]研究表明，冰凍較4℃保存相比，盡管可以提供更多數(shù)量的活細胞，但成冰作用的壞死、滲透性的改變以及凋亡過程等都直接降低了細胞活力，并且導(dǎo)致炎性物質(zhì)的釋放和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達。

3.5鈷60(Co60)照射處理：有學(xué)者報道術(shù)前應(yīng)用Co60照射肋軟骨，可降低同種異體肋軟骨的抗原性，減輕炎癥反應(yīng)，減少軟骨吸收[22]。

另外，還有一些方法可不同程度地降低軟骨的免疫原性。張晨等[23]報道采用低滲的Triton X-100為主的脫細胞方法脫去人耳軟骨細胞，使人耳軟骨抗MHC I反應(yīng)由陽性轉(zhuǎn)為陰性，有效地去除了移植物的抗原性。此外，軟骨細胞在分離和體外培養(yǎng)過程中酶消化也可能造成膜受體丟失，從而降低了細胞的抗原性[24]。

4展望

軟骨移植免疫反應(yīng)降低或預(yù)防措施目前取得了一定的成效，但尚無理想的方法，且多是通過純粹的免疫學(xué)途徑來進行干預(yù)。眾所周知，軟骨移植物的破壞及排斥反應(yīng)的發(fā)生主要是由于細胞外基質(zhì)降解致軟骨細胞暴露，進而細胞膜表面的MHC分子與宿主免疫性物質(zhì)相接觸所引起[11]。據(jù)此推想，今后的研究是否可以從基質(zhì)降解的始動環(huán)節(jié)入手，通過抑制負責(zé)基質(zhì)降解的酶來保持基質(zhì)的完整性，發(fā)揮其免疫屏障作用，以降低軟骨移植的免疫排斥反應(yīng)，從而保持軟骨移植物在體內(nèi)的長期存活。

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[收稿日期]2007-12-19 [修回日期]2008-02-20

編輯/李陽利

注：“本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文?！?/p>