活性炭和振蕩培養(yǎng)對(duì)提高大白菜胚誘導(dǎo)率的影響

摘要：以11個(gè)大白菜品種(品系)為材料，采用NLN培養(yǎng)基進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，研究了活性炭和振蕩培養(yǎng)對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)和形成的影響。結(jié)果表明：11個(gè)大白菜品種有9個(gè)誘導(dǎo)出胚，每花蕾誘導(dǎo)胚數(shù)0.056～12.67個(gè)。在NLN-13培養(yǎng)基中添加活性炭(0.5g/L)，有利于小孢子胚的誘導(dǎo)和形成，Y536和Y585胚誘導(dǎo)率分別提高了16.1和4.8倍，極難誘導(dǎo)出胚的材料Y516也誘導(dǎo)出胚；采用振蕩培養(yǎng)方式(65r/min)，Y531和Y445胚誘導(dǎo)率較靜置培養(yǎng)分別提高了18.23％和30.91％，出胚時(shí)間提早2～4d。

關(guān)鍵詞：大白菜；游離小孢子培養(yǎng)；小孢子胚；誘導(dǎo)率；活性炭；振蕩培養(yǎng)

雙單倍體(DH)純系材料在蔬菜育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值。游離小孢子培養(yǎng)(IMC)是快速獲得DH純系的一種有效方法，與常規(guī)多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩(wěn)定等特點(diǎn)。在蕓薹屬作物中，先后對(duì)油菜、芥菜、大白菜、小白菜、甘藍(lán)和蕪菁等進(jìn)行了游離小孢子培養(yǎng)并獲得了再生植株。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)的某些因素(基因型、培養(yǎng)基、供體植株的生長(zhǎng)條件、高溫預(yù)處理等)進(jìn)行了研究，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和改進(jìn)培養(yǎng)方法，使部分材料小孢子胚產(chǎn)量有了明顯的提高。但一些難誘導(dǎo)的材料胚產(chǎn)量低而不穩(wěn)定，限制了該方法在生產(chǎn)中的應(yīng)用。筆者利用在培養(yǎng)基中添加活性炭和采用振蕩培養(yǎng)的方法，對(duì)大白菜游離小孢子培養(yǎng)胚的誘導(dǎo)和形成進(jìn)行了研究，獲得了較理想的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2005年9月至2007年10月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜研究室進(jìn)行。供試材料為來(lái)自不同省市的11個(gè)大白菜品種或自交系。材料類(lèi)型具有廣泛的代表性。各材料在前1年秋季將種子播于大田，自然越冬后于第2年春季3月10日至4月20日進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

游離小孢子培養(yǎng)提取沖洗液采用B5基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度13％，pH值5.8，高壓滅菌。小孢子培養(yǎng)液采用NLN基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度13％，pH值5.8，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾滅菌，過(guò)濾液分裝到三角瓶中。每瓶20～30mL，備用。

1.3 方法

從供體植株主花序或頂部分枝花序上取2.0～4.0mm長(zhǎng)花蕾，在顯微鏡下鏡檢小孢子確定發(fā)育時(shí)期，選取小孢子處于單核中期至雙核初期的花蕾(2.0～3.0mm)，用75％酒精浸30s，0.1％HgCl₂消毒5min，無(wú)菌水沖洗3次以上。然后將花蕾置入10mL試管中，加入Keller-13沖洗液3～5mL，用玻棒擠破花蕾散出小孢子，將小孢子懸浮液用400目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液在600r/min下離心3min，沉降小孢子，棄去上清液。再加入Keller-13沖洗液，重新懸浮小孢子。離心重復(fù)3次。最后加入NLN-13培養(yǎng)液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整小孢子濃度為1×10⁵個(gè)/mL。將小孢子懸浮液分裝至60mm×15mm培養(yǎng)皿中，每皿2mL，用Parafilm膜封口。小孢子先放入33℃恒溫培養(yǎng)箱中高溫培養(yǎng)24h，然后轉(zhuǎn)入25℃下黑暗培養(yǎng)，每天取少量材料觀察小孢子分裂情況和形成小細(xì)胞團(tuán)數(shù)目。培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)小孢子胚數(shù)目。

誘導(dǎo)率(胚/蕾)=誘導(dǎo)小孢子胚數(shù)/培養(yǎng)花蕾數(shù)

1.3.1 基因型比較 采用筆者報(bào)道的方法，以添加13％蔗糖的NLN液體培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)條件均一致，比較不同基因型對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)率的影響。

1.3.2 活性炭處理 選取胚誘導(dǎo)率高低不同3個(gè)基因型材料(Y531、Y516、Y536)，每個(gè)材料均分2組處理。1組處理中加入0.5g/L活性炭，另1組不加。比較活性炭對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)的影響。

1.3.3 培養(yǎng)方式 選取胚誘導(dǎo)率不同的Y531、Y445和95-12 3個(gè)基因型材料，每個(gè)材料分別進(jìn)行振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)頻率65r/min，比較不同培養(yǎng)方式對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型大白菜胚誘導(dǎo)率比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的11個(gè)基因型材料中有9個(gè)誘導(dǎo)形成了小孢子胚，材料誘導(dǎo)成功率達(dá)81.8％。不同基因型材料間胚誘導(dǎo)率差別極大，最高的Y191每花蕾誘導(dǎo)胚(誘導(dǎo)率)12.67個(gè)；較低的Y516每花蕾誘導(dǎo)胚0.056個(gè)，二者相差226倍。而自交系ZY15和72049均未誘導(dǎo)出小孢子胚，其原因有待研究。從培養(yǎng)結(jié)果可以將大白菜區(qū)分為易誘導(dǎo)、胚產(chǎn)量高的基因型與難誘導(dǎo)、胚產(chǎn)量低的基因型。其中，Y191、Y360、Y531、Y536、95-12、58為易誘導(dǎo)基因型，每花蕾誘導(dǎo)胚在1個(gè)以上；而Y585、Y445、Y516、ZY15、72049為難誘導(dǎo)基因型材料，每花蕾誘導(dǎo)胚在1個(gè)以下，表明基因型是影響游離小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)成功與否的關(guān)鍵因素。

2.2 活性炭對(duì)大白菜小孢子胚誘導(dǎo)的影響

選取胚誘導(dǎo)率不同的基因型材料(Y585、Y536和Y516)，分別在NLN-13液體培養(yǎng)基中添加0.5g/L活性炭，與不添加活性炭的對(duì)照進(jìn)行比較，觀察活性炭對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)的影響。3個(gè)材料在添加0.5g/L活性炭后，小孢子胚誘導(dǎo)率均有顯著提高。Y536添加活性炭處理平均每花蕾誘導(dǎo)胚71.92個(gè)，是不加活性炭對(duì)照誘導(dǎo)率的16.1倍，Y585每花蕾誘導(dǎo)胚3.31個(gè)，是對(duì)照誘導(dǎo)率的4.8倍；Y516平均每花蕾可誘導(dǎo)胚0.44個(gè)，而不添加活性炭的對(duì)照未誘導(dǎo)出小孢子胚。從中可以看出，活性炭對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)具有明顯的促進(jìn)作用，特別是難誘導(dǎo)的基因型材料，添加活性炭能使小孢子胚誘導(dǎo)率明顯提高。

2.3 培養(yǎng)方式對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)的影響

選取胚誘導(dǎo)率不同的Y531、Y445和95-12 3個(gè)基因型材料，每個(gè)材料分別進(jìn)行振蕩和靜置培養(yǎng)，比較在NLN-13培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)方式對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)的影響。雜交種Y531由靜置變?yōu)檎袷幣囵B(yǎng)，每花蕾誘導(dǎo)小孢子胚(誘導(dǎo)率)從9.05個(gè)提高到10.7個(gè)，誘導(dǎo)率提高了18.23％；Y445每花蕾誘導(dǎo)胚數(shù)從0.55個(gè)提高到0.72個(gè)，誘導(dǎo)率提高了30.91％。另外，2個(gè)材料振蕩較靜置培養(yǎng)誘導(dǎo)形成小孢子胚的時(shí)間縮短2～4d，加快了胚誘導(dǎo)形成的速度和提高了胚的質(zhì)量。而自交系95-12小孢子胚誘導(dǎo)率差別不明顯，但誘導(dǎo)形成小孢子胚的時(shí)間縮短了2d。表明振蕩培養(yǎng)較靜置培養(yǎng)可縮短小孢子胚誘導(dǎo)形成的天數(shù)并提高胚的質(zhì)量。

3 討論和結(jié)論

筆者對(duì)大白菜游離小孢子培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，春秋不同類(lèi)型大白菜品種均可誘導(dǎo)出一定數(shù)量的小孢子胚。在供試的11個(gè)基因型材料中，有9個(gè)形成了胚。材料誘導(dǎo)成功率為81.8％。但不同基因型間最高和最低材料每花蕾誘導(dǎo)小孢子胚數(shù)(誘導(dǎo)率)相差226倍。Y191、Y360和Y531每花蕾誘導(dǎo)小孢子胚在10個(gè)以上，而Y445、Y516和Y585小孢子胚誘導(dǎo)率極低，每花蕾誘導(dǎo)小孢子胚在1.0個(gè)以下。雜交種小孢子胚的誘導(dǎo)率與品種來(lái)源和性狀關(guān)系不大，這與筆者以往研究的結(jié)果相同。自交系材料小孢子胚誘導(dǎo)率較低，在培養(yǎng)的4份材料中僅有2份誘導(dǎo)出了小孢子胚，且小孢子胚誘導(dǎo)率較低，在2.4個(gè)以下，其原因與自交系材料植株長(zhǎng)勢(shì)弱，花粉活力差有關(guān)。基因型的差別可能是由細(xì)胞核某些功能基因作用的結(jié)果，

大白菜游離小孢子培養(yǎng)以NLN-13培養(yǎng)基添加0.5g/L活性炭的培養(yǎng)效果較好，供試的3個(gè)基因型材料小孢子胚誘導(dǎo)率均有顯著提高。其中Y585和Y536分別是不添加活性炭對(duì)照的4.8和16.1倍：而Y516平均每花蕾誘導(dǎo)胚0.44個(gè)，而不添加活性炭的對(duì)照未誘導(dǎo)出小孢子胚。活性炭對(duì)提高小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)率的作用非常顯著。這與以往田保明等在油菜中的研究結(jié)果相同。活性炭是一種吸附劑，推斷可能是與活性炭在游離小孢子培養(yǎng)中吸附了培養(yǎng)基中產(chǎn)生和小孢子釋放的有毒有害物質(zhì)有關(guān)。0.5g/L活性炭是否是大白菜游離小孢子培養(yǎng)的最佳濃度有待于進(jìn)一步研究。

采用振蕩培養(yǎng)代替靜置培養(yǎng)有利于小孢子胚的誘導(dǎo)和形成。雜交種Y531和Y445在NLN-13液體培養(yǎng)基中由靜置培養(yǎng)變?yōu)檎袷幣囵B(yǎng)時(shí)，小孢子胚誘導(dǎo)率分別提高了18.23％和30.91％。另外，形成胚的時(shí)間縮短了2～4d，加快了胚誘導(dǎo)形成的速度和提高了胚的質(zhì)量。而自交系95-12 2種培養(yǎng)方式胚誘導(dǎo)率差別不明顯，但誘導(dǎo)形成胚的時(shí)間縮短了2d。其原因可能是與振蕩培養(yǎng)增加了培養(yǎng)容器的透氣性，促進(jìn)了呼吸作用。把小孢子和小細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)中產(chǎn)生的不利于生長(zhǎng)的物質(zhì)迅速稀釋有關(guān)。在游離小孢子培養(yǎng)中添加適量的活性炭，采用振蕩培養(yǎng)的方法，是提高游離小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)率的一種行之有效的方法。