中藥治療黃褐斑實驗研究進展

黃褐斑（Melasma）是一種獲得性色素沉著性皮膚病，多發于中青年女性，病程頑固，嚴重影響患者美觀，給其精神和生活帶來諸多煩惱和痛苦。而中藥治療黃褐斑具有突出整體調節、副作用小、療效穩定等優點，故成為治療黃褐斑的有效理想途徑。從20世紀90年代開始，我國中醫藥工作者在中藥治療黃褐斑的實驗研究方面做了大量卓有成效的工作，新技術、新手段不斷被引入，新思路、新方法大量涌現。本文就近年來中藥治療黃褐斑的實驗研究方法綜述如下。

1臨床實驗研究

臨床為中藥實踐的大舞臺，中藥治療黃褐斑的實驗研究也是從臨床開始的。羅小光等[1]考察了燈盞花素與中藥內服外敷聯合運用對女性黃褐斑患者血清性激素水平的影響，患者血清E2明顯下降，FSH、LH雖無統計學意義，但低于對照組，T在療前療后均無顯著性變化，表明此種聯合治療方法可能是通過調節內分泌、平衡性激素水平而達到改善黃褐斑的目的。劉冬梅等[2]觀察腎陽不足型黃褐斑患者的發病機制并驗證養顏青娥丸的有效性及作用機理，發現養顏青娥丸能提高腎陽不足型黃褐斑患者血清的超氧化物歧化酶(SOD) 活性并降低丙二醛(MDA)的活性和血清 E2的水平，從而降低酪氨酸酶活性，減少黑素的形成，使黑素的形成受到抑制而對黃褐斑產生療效。張琳等[3]采用雙盲法進行沙棘斑婷含片改善黃褐斑的試驗，有效率為69.81%，受試者主觀感覺良好，血液生化指標均正常。張紅梅等[4]進行了沙棘清妍膠囊祛黃褐斑的實驗研究，總有效率60%，試驗前后受試者血常規、尿常規及血生化指標均在正常范圍，對試驗者身體健康無明顯影響。

2動物實驗研究

黃褐斑藥理動物模型的研究也正在起步，研究方法有紫外光照射法、雌激素攻擊法等，但仍屬探索階段，至今尚無公認可行的造模方法。潘揚等[5]用中波紫外線照射雌性白色豚鼠1個月，豚鼠皮膚黑素沉著增加，皮膚和肝臟的酪氨酸、MDA含量明顯升高，SOD含量降低，表明紫外線攻擊雌性白色豚鼠可作為黃褐斑的實驗動物模型。汪南玥等[6]采用黃體酮+紫外線+束縛復合法建立肝郁型黃褐斑小鼠模型，給小鼠注射黃體酮，同時進行慢性束縛和紫外線局部照射，較其他方法更能導致皮膚MDA升高和 SOD降低以及皮膚黑素細胞的增加，并且具有肝郁證的行動學表現，模型獲得成功。王志國等[7]用黃體酮攻擊雌性小鼠復制黃褐斑實驗動物模型，探討蝴蝶霜治療黃揭斑的作用機理，證明蝴蝶霜能提高局部皮膚組織中SOD活性和羥脯氨酸含量，降低乳過氧化物酶(LPO)和脂褐質含量，消除多余自由基，從而抑制黃褐斑的產生。金道山等[8]采用老年雌性大鼠為實驗動物模型，觀察大豆異黃酮軟膠囊治療黃褐斑與其抗氧化能力間的關系，發現大豆異黃酮軟膠囊能提高大鼠血及肝組織中SOD、GSH-PX活性，降低MDA含量，提示大豆異黃酮軟膠囊治療黃褐斑與其抗氧化能力間有密切關系。李洪武等[9]選定體外對酪氨酸酶活性有顯著抑制作用的中藥，應用棕黃色豚鼠UVB照射誘導皮膚色素沉著實驗動物模型，觀察外用中藥后黑素細胞數量和形態的改變，結果白術、茯苓、山茱萸等中藥組多巴陽性黑素細胞數及含黑素顆粒細胞數較對照組明顯減少，對UVB誘導的色素沉著具有抑制作用；又選擇對酪氨酸酶活性和皮膚黑素生成均具有顯著抑制作用的中藥制成乙醇提取液，UVB照射后外用于豚鼠背部皮膚，采用半定量RT-PCR檢測藥物干預前后豚鼠皮膚中酪氨酸酶mRNA表達水平，結果顯示茯苓、白術能在基因轉錄水平下調酪氨酸酶RNA表達，抑制酶蛋白的生物合成 [10]。

3酪氨酸酶抑制實驗

通過研究中藥對黑素生物合成過程中的關鍵酶—酪氨酸酶的激活或抑制作用，為中藥治療黃褐斑提供選擇。酪氨酸酶(TYR)是皮膚黑素生物合成的主要限速酶，控制其活力即可控制黑素生成量。李艷莉等[11]測定6種中藥對酪氨酸酶活性的抑制率，白芷、白附子、當歸、云苓、蒺藜、銀杏葉對酪氨酸酶活性的抑制率分別為35.14%、55.86%、30.63%、21.62%、54.46%、39.29%，白附子對酪氨酸酶活性抑制作用最強。夏蕾等[12]用電腦篩選出高頻次治療色素增加性皮膚病的中藥，研究其對酪氨酸酶的活性影響，發現白術、白僵蠶、藁本、白芨、白附子等15味中藥有使酪氨酸酶活性增加的作用；治療色素性皮膚病最常用的復方中藥中，六味地黃丸、補中益氣湯、復方金匾腎氣丸及茯苓、山藥、山茱萸能使酪氨酸酶活性降低，柴胡舒肝湯、白蝕丸復方及熟地黃、牡丹皮能使得酪氨酸酶活性增加；單體18-甘草酸雙氨鹽、蘆薈素、肉桂酸、苦參堿對酪氨酸酶活性和黑素形成有抑制作用。雷鐵池等[13]對中醫治療色素增加性皮膚病方劑69首進行計算機拆方排序，選出高頻次出現中藥82味，觀察這些中藥乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶和無細胞系統多巴色素自動氧化生成黑素量的影響；結果顯示11味中藥乙醇提取物在3個不同濃度對酪氨酸酶活性和黑素生成量呈劑量依賴性抑制，其中白術、白僵蠶、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿葉對酪氨酸酶活性抑制率與單體化合物熊果苷無統計學差異；進一步研究這些中藥的皮膚脫色機制及評估其臨床應用，發現白術、茯苓等體外可顯著抑制蘑菇酪氨酸酶活性。還有學者認為部分中藥對酪氨酸酶（TYR）有雙向調節作用，許振毅等[14]發現高濃度蘆薈大黃素和低濃度大黃次酸對TYR的抑制率分別為54%和55%，低濃度的蘆薈大黃素和高濃度的大黃次酸對TYR活性可提高至70%和81%。

4對黑素細胞影響的研究

黑素細胞是一種腺細胞，黑素是其分泌產物，為吲哚和醌與蛋白質結合的高分子聚合物。

4.1 對小鼠黑素瘤細胞影響的研究：B-16黑素瘤細胞株的基本結構，特別是黑素合成功能與人正常的皮膚黑素細胞基本一致，在人體原代皮膚黑素細胞培養非常困難的情況下，國外化妝品生產企業的科研單位，在篩選美白祛斑劑的過程中，廣泛采用該細胞株作為美白化學物功效測定的受試細胞。雷鐵池等[15]通過B-16小鼠黑素瘤細胞對幾種美白化學物進行測試發現，熊果苷可明顯抑制黑素合成。李玲等[16]利用B-16小鼠黑素瘤細胞研究顯示，熊果苷、曲酸衍生物、BL-99和氫醌酯均可抑制黑素細胞的生長和黑素合成，具有一定的美白效果，其機制可能不僅僅與酪氨酸酶活性有關。周婧等[17]研究表明，小鼠B-16 黑素瘤細胞經槲皮素作用后，細胞內TYR mRNA和蛋白表達上調，活性增強，進而黑素合成增多；槲皮素濃度＜60μmol/L時，無細胞毒性，且有輕度的促進細胞增殖的作用。陳氏等[18]研究表明，養顏青娥丸能明顯抑制小鼠B-16黑素瘤細胞的增殖，并降低酪氨酸酶的活性、減少黑素的合成，證實了其對腎虛型黃褐斑的治療作用。

4.2 對melan-a細胞影響的研究：Melan-a鼠黑素細胞株系來源于新生C57BL鼠皮膚的永生化二倍體黑素細胞，基因型為agouti/agouti（純合子，顯性），該細胞保留了正常黑素細胞的特征；Melan-a鼠黑素細胞株接種到同種系小鼠或裸鼠身上，不能誘發黑素瘤的發生，該細胞株廣泛應用于黑素轉運、藥物對黑素合成的影響等方面研究[19-20]。Me1an-a鼠黑素細胞株細胞比B16、S91等黑素瘤細胞株更接近于普通黑素細胞，成為人們研究體外黑素細胞生物學特性的合適媒介。魯嚴等[21]研究蘆薈素對Melan-a鼠黑素細胞株的黑素生成及其相關基因表達的影響，表明蘆薈素能夠顯著抑制Melan-a鼠黑素細胞株的TYR活性、黑素量和TRP-1/TRP-2 mRNA的表達水平，直接測定黑素細胞TYR濃度和黑素量比檢測TRP-1/TRP-2 mRNA更能確切地反映蘆薈素對黑素細胞的影響。又觀察了苦參堿和肉桂酸對melan-a小鼠黑素細胞黑素生成的影響，表明苦參堿和肉桂酸均有抑制melan-a小鼠黑素細胞酪氨酸酶活性的作用及使黑素合成量減少的作用，且苦參堿作用強于肉桂酸，而肉桂酸有促進黑素細胞樹突形成的作用[22]。

4.3對正常人黑素細胞影響的研究：體外培養的哺乳動物或人的黑素瘤細胞的增殖潛能及細胞內信號轉導機制均與正常黑素細胞不同。體外培養的正常人表皮黑素細胞，更為接近在體環境。丁國斌等[23]利用堿性成纖維細胞生長因子為主要有絲分裂原建立正常人表皮黑素細胞培養系， 研究發現熊果苷對體外培養的正常人黑素細胞酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制，可顯著減少黑素生成量，對黑素細胞活力影響很小，表明熊果苷對體外培養的人黑素細胞的酪氨酸酶活性及黑素生成有顯著抑制作用，且細胞毒性很低。楊壯群等[24]研究蘆薈苦素對體外培養的正常人表皮黑素細胞的作用效應，蘆薈苦素對體外培養的正常人黑素細胞酪氨酸酶活性呈濃度依賴性抑制，可顯著減少黑素生成量，對黑素細胞活力影響很小。雷水生等[25]研究了六味地黃丸對體外培養正常人黑素細胞的抑制作用，顯示六味地黃丸對黑素細胞增殖有抑制作用，能使細胞數明顯減少、黑素合成顯著下降、酪氨酸酶活性減弱， 六味地黃丸可通過阻止和清除活性氧基的作用使酪氨酸酶生成多巴、多巴生成多巴醌兩個步驟受到阻礙，使黑素生成稀少，酪氨酸酶活性下降，為六味地黃丸治療黃褐斑提供了實驗依據。

5對黑素細胞和角質形成細胞復合模型影響的研究

黑素細胞與鄰近細胞間的相互作用不容忽視，故黑素細胞和角質形成細胞共培養提供了一種更好的檢測模型。

5.1 對鼠黑素細胞和角質形成細胞的共培養：Lei等[26]使用小鼠永生化黑素細胞(Melan-a)和角質形成細胞(SP-1)建立了一個靈敏、可信、可重復的檢測色素合成調節劑的共培養模型。Yoon等[27]優化了這種測試系統，使用這一模型能大規模地篩選色素調節劑，并能在一個類似生理環境的系統中研究黑素細胞和角質形成細胞的相互作用及闡明色素調節劑的作用機制。仲少敏等[28]選取中藥在 melan-a與SP-1共培養體系做實驗研究，結果五倍子、威靈仙、白果、川芎在細胞培養水平對黑素生成有顯著抑制作用。

5.2 對人黑素細胞和角質形成細胞的共培養：蘭海龍等[29]以包皮組織作為細胞來源，體外構建黑素細胞與角質形成細胞直接接觸的混合培養模型，檢測蘆薈苦素、熊果苷及茶多酚作用于此模型后對黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影響，發現三種褪色劑均對黑素細胞酪氨酸酶活性及黑素合成產生濃度依賴性抑制，以茶多酚作用最強，蘆薈苦素次之。解士海等[30]成功建立黑素細胞與角質形成細胞共培養的體外模型，共聚焦顯微鏡下直接觀察到黑素向角質形成細胞的轉運。

6對體外重建皮膚類似物的影響

皮膚類似物是應用組織工程技術將體外培養擴增的大量具有增殖能力的皮膚細胞，種植在具有生物相容性的生物材料上，在體外持續培養以獲得與正常在體皮膚相似的人工皮膚[31]。參考正常皮膚中黑素細胞的數量，將黑素細胞與角質形成細胞按適當的比例混合，可進一步構建能夠調節皮膚色素生成的色素化皮膚類似物。劉源等[32]以包皮組織作為細胞來源，采用消化法獲得角質形成細胞、成纖維細胞和黑素細胞，在自行設計的組織工程皮膚培養系統構建皮膚類似物，獲得的皮膚類似物結構完整，細胞狀態良好，Dopa染色、透射電鏡和S-100免疫組織化學檢測均顯示含有大量黑素細胞并處于良好狀，成功構建了含黑素細胞的色素化皮膚類似物。商品化皮膚類似物更為哺乳動物黑素生成因子的調控及作用機制解釋的研究，提供了一個更方便、有效的選擇[33]。

7小結

尋找組方合理、高效安全的中藥美白祛斑制劑，一直是藥學和化妝品領域的一個研究熱點。近年來，新技術和新方法不斷引入，但仍然存在很多問題。基礎理論研究非常薄弱、滯后，臨床療效觀察多，實驗研究與臨床研究文獻的比例很低。國內對中藥祛斑成分的篩選研究多集中于酪氨酸酶的抑制作用上，以及在此基礎上以黑素瘤細胞和動物模型進行的實驗，肯定了一些中藥對黑素代謝的作用，但是酪氨酸酶抑制實驗結果不是很一致，甚至有的互相矛盾。細胞水平的研究更接近于體內狀態，在研究藥物對黑素細胞的作用時，角質形成細胞是不能忽略的因素。黑素細胞和角質形成細胞共培養模型用于黑素代謝的研究，一方面使實驗更接近體內環境，另一方面可以發現通過角質形成細胞而間接抑制黑素合成的藥物。以色素化皮膚類似物為模型來篩選祛斑藥物，不僅同時考慮到了黑素細胞與角質形成細胞和成纖維細胞的交互作用，而且還考慮到了空間因素的影響，黑素細胞所處的環境更接近體內，是一種更好的模型。但是，構建色素化皮膚類似物操作復雜，所需時間長(至少培養4周)，適合于藥物的精確篩選[34]。可見，采用黑素細胞與角質形成細胞共培養模型作為初步篩選平臺，采用色素化皮膚類似物對重點成分的作用及機理進行深入的研究，將成為中藥治療黃褐斑實驗研究的新模式。

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[收稿日期]2008-04-05[修回日期]2008-06-12

編輯/李陽利