毛囊來源干細胞及其在組織工程皮膚中的研究現狀

成體干細胞（adult stem cells）是一類存在于具有自我更新功能組織中的原始細胞，它具有高度增殖潛能和終生無限的自我更新能力，在細胞的生長和分化過程中起主導作用[1]。而毛囊的周期性生長提示毛囊結構中也存在著成體干細胞，稱為毛囊干細胞。毛囊干細胞的應用途徑有多種，組織工程皮膚便是其應用中充滿前景的一條。組織工程皮膚的構建早已開始，開始是將角質形成細胞作為種子細胞[2]，其后又采用表皮干細胞為種子細胞構建了組織工程皮膚[3]，但構建的皮膚存在排異、供皮量有限、無法構建皮膚附屬器等問題。由于毛囊干細胞具有多向分化的潛能，可構建包含皮膚附屬器以及黑素細胞的皮膚，在臨床應用前景更為廣闊，已成為組織工程皮膚重點研究的種子細胞。

1毛囊的結構

毛囊是由表皮向下凹陷形成，由上至下分為漏斗部、峽部、莖部、球部四個部分，可發生周期性改變。由內至外分為上皮性毛根鞘和毛囊周圍鞘兩部分，兩者之間有玻璃膜。上皮性毛根鞘起源于表皮，又分為外根鞘和內根鞘。外根鞘相當于表皮的基底層和棘細胞層，在峽部末端外毛根鞘細胞增殖，并且形成隆起，通常稱其為隆突部。內根鞘由亨利層和赫胥黎層構成。

2毛囊來源干細胞

來源于毛囊中的成體干細胞稱為毛囊來源干細胞。毛囊結構中包含有多種干細胞，如表皮干細胞、真皮干細胞、黑素干細胞等，它們各自的表明標志，組織定位，具體功能等都不盡相同。表皮干細胞(Epithelial stem cells)即我們研究最多的毛囊來源干細胞（后文簡稱毛囊干細胞），它的定位、表面標志及調控途徑將在后文中作詳細闡述。真皮干細胞(Dermal stem cells)毛囊真皮細胞最先被發現具有干細胞和組細胞特性是在對胡須的毛囊組織進行再生實驗時發現的[4]。這類真皮干細胞主要存在于真皮乳頭和真皮鞘中，在某種程度上來自這兩處的細胞是可以互換的[5]。Reynolds等[6]從成人毛囊真皮中分離得到的細胞被發現具有誘導形成各種上皮細胞并進而形成毛囊結構的能力。還有研究人員通過標記的真皮細胞證實了皮膚中的真皮細胞在創傷后能夠由毛囊的真皮細胞完全再生[7]。黑素細胞干細胞（Melanocyte stem cells），目前研究發現在毛發外毛根鞘中存在著處于某一分化階段的黑素細胞干細胞[8]。也有實驗證明了黑素干細胞的存在[9-10]。但目前為止，對于黑素干細胞還未發現特異的分子標記。近年有研究者發現Pax3和Mitf是控制黑素干細胞維持和分化的關鍵表面分子[11]。

3毛囊干細胞的定位

早期人們在毛球部發現該部分細胞分裂顯著，故推測毛球是細胞分裂和毛囊生長期起始的重要部位，毛球部可能含有干細胞[12-13]。隨著研究的深入，毛囊干細胞的眾多特性被發現，慢周期性便是其中之一[1]。Cotsarelis等[14]使用3H-TdR對小鼠皮膚進行連續標記，4周后發現95％以上的毛囊隆突部細胞仍保持標記，從而提出了隆突激活假說（bulge activation hypothesis）。此后，Taylor等[3]采用Brdu和3H雙標記滯留方法亦證實毛囊干細胞定位于上段的隆突區。Oshima等[15]利用轉基因方法構建了表達β半乳糖苷酶的小鼠毛囊來證實毛囊干細胞定位于隆突部。雖然有大量的實驗證實隆突部存在毛囊干細胞，但利用干細胞慢周期特性和毛囊生長周期特點對人毛囊進行體外分析發現，毛囊干細胞在胚胎期定位于隆突區，而在成人中，有部分毛囊干細胞還存在于毛囊下段隆突區以下的外根鞘中[16]，即毛囊中有兩個干細胞庫。故對毛囊干細胞的確切定位尚有爭議。

4毛囊干細胞表面標志

毛囊干細胞的表面標志是分離、鑒定毛囊干細胞的重要依據。目前為止，毛囊干細胞尚缺乏具有高度特異性的表面標志，但近年來，利用各種標志和各種技術對毛囊干細胞進行分離取得了一些進展[17]，所發現的相對特異的表面標志有以下幾個。

4.1 整合素：表皮干細胞表面常高表達某些介導干細胞與基底膜粘附的整合素，β1整合素便是現在認為毛囊干細胞存在的標志之一。對表皮基底層細胞的β1整合素進行標記后檢測，發現表達β1整合素的細胞具有更高的克隆形成率[18]。近年還有研究發現表達α6整合素的細胞，通過與β4整合素的作用接和于基膜，這類細胞比表達β1整合素的細胞有更高的增殖潛能[19]。Kaur等[20]發現表皮基底層α6表達陽性、10G7表達陰性的細胞比β1表達陽性、10G7表達陰性的細胞具有更高的增殖潛能，預示整合素α6可能是比β1更好的分子標記。但盡管如此，β1整合素和α6整合素由于在某些不具有干細胞特性的細胞中也能高表達，仍不能認為是毛囊干細胞的特異性標志[21]。

4.2 CD34：CD34在鼠的毛囊隆突區的細胞中有表達[22]，而且表達CD34的細胞同時與標記滯留細胞一致，與CD34－細胞相比，CD34＋細胞表現出較強的增殖潛能， Raposio等[23]也利用免疫組化方法在毛囊處發現了表面標志CD34與Ki67。但是CD34在人毛囊結構中并沒有表達[24-25]，并不能用來對人的毛囊干細胞進行分離。只是由于它是鼠毛囊干細胞中較好的表明標志，所以是用來研究毛囊干細胞的工具之一。

4.3 p63：p63轉錄因子是p53同源的腫瘤抑制基因，它與產生短暫增殖后裔的過程有關，是維持表皮基底角質形成細胞增生潛能必需的。Pellegrini等[26]通過在體外檢查p63表達與克隆形成率，發現細胞的克隆形成率與p63的表達率呈正相關，因此將p63作為鑒定表皮干細胞的一種標志。但p63同樣在毛間質細胞中高表達，而這種間質細胞是缺少增殖能力的[27]。因此p63作為毛囊干細胞的特異標記尚待商定。

4.4 角蛋白：角蛋白是一類最早用來定位表皮干細胞的標志，特別是K15和K19。對人頭皮組織運用免疫組化方法檢測發現人毛囊中細胞表達K15并與標記滯留細胞一致，而且K15不與增殖標記Ki-67發生免疫反應[28]，表明了K15是慢周期細胞的表面標志。K19也認為是毛囊干細胞的表面標志之一，一個主要的實驗基礎是表達K19的毛囊膨出區細胞正是標記滯留細胞的所在[29]。雖然K19也表達與隆突部細胞并且不存在于分裂活躍的細胞中，但它并不與K15共表達。K19在外根鞘的細胞中也有表達，特別是在外根鞘下三分之一的部分，該部分被認為可能是毛囊中干細胞除了隆突部以外的第二個貯存處。

4.5 其他標志：還有一些表面標志如CD71和CD200也被用來鑒定毛囊干細胞。CD71為干細胞表面的轉鐵蛋白受體，能被單抗10G7識別。Kaur等[20]發現10G7表達陽性的表皮細胞與1OG7表達陰性而α6和β1表達均陽性的表皮細胞相比具有更強的再生能力。Li等[19]從新生兒分離出α6表達陽性CD71表達陰性的細胞，具有長期分裂潛能和較高的克隆形成效率，且與標記滯留細胞共表達。這些結果都表明CD71作為毛囊干細胞表明標志的可能。研究表明CD200存在于毛囊隆突部細胞，并且在免疫和炎癥調節方面起著重要的作用[30-31]。Ki67也被認為是細胞具有活躍周期的標志，并提示毛囊處于生長期[32]。

5毛囊干細胞在組織工程皮膚中的研究及展望

組織工程皮膚是目前唯一運用于臨床的組織工程產品，目前表皮干細胞作為種子細胞構建的組織工程化皮膚已應用于臨床燒傷患者[33]，但仍存排異或供皮量有限等問題。除此之外，現有的種子細胞構建的組織工程皮膚不含有皮膚附屬器。但隨著毛囊干細胞的出現以及研究的深入，組織工程皮膚有望解決上述的各種問題，研究證實毛囊干細胞比毛囊間表皮干細胞更有增生能力，并具有形成皮膚附屬器的能力[14-15]。利用毛囊干細胞作為種子細胞可用于構建以下幾個類型的組織工程皮膚。

5.1 構建含毛囊結構的組織工程皮膚:有研究發現，從成年生長期毛囊分離的毛乳頭放于表皮附近可誘導形成新的毛囊[34]。Renolds等[35]移植頭皮毛囊結締組織后發現了新毛囊的形成。這類組織工程皮膚中包含毛囊結構，可以有毛發生長，從根本上解決了脫發問題，相較現在的各種毛發種植技術無疑有更大的優勢，為某些棘手的皮膚、毛囊疾病帶來了希望。

5.2 構建含黑素細胞的組織工程皮膚用于色素脫失疾病的治療：皮膚色素脫失疾病，由于病因不清，尚無理想的單純藥物治療方法。移植黑素細胞治療色素脫失，有一定治療效果，但也存在著治療后色素深度不易控制、長期療效不夠穩定等問題。1971年，Falabela首次報道以自體表皮移植治療白癜風獲得成功，20世紀90年代，Falabella又以自體皮膚點狀移植治療白癜風獲得成功。但是自體皮膚移植存在很大的局限：需大面積取皮，給患者帶來新的創面和繼發瘢痕。毛囊干細胞構建的組織工程皮膚無疑是治療色素脫失的一條希望之路。1982年，美國學者Eisinger與Marko首先培養黑素細胞獲得成功。目前研究發現有一類黑素細胞干細胞廣泛分布于生長期外毛根鞘中[8]。很多實驗都證實了黑素細胞干細胞的存在[9-10]。以毛囊來源干細胞作為細胞來源，實現人工皮膚替代物的構建并應用于臨床色素脫失的治療。這無疑拓展組織工程皮膚代用品的應用范圍，提升了色素脫失的治療水平。

5.3 構建含有汗腺、皮脂腺結構的組織工程皮膚:我們從毛囊干細胞增殖分化的調控中可以知道，當wnt信號被抑制時，毛囊干細胞便會向皮脂腺和表皮方向分化，因此構建含有皮脂腺結構的組織工程皮膚很有前景。皮脂腺結構可以更好地給皮膚提供油脂的潤澤，防止皮膚的龜裂，為構建后的組織工程皮膚提供了更好的存活環境。雖然毛囊干細胞構建組織工程皮膚的前景美好，但尚存在一些問題有待解決，如干細胞的鑒定分離、毛囊干細胞體外培養時傳代數短、短暫擴增細胞的獲得以縮短干細胞的擴增時間、定向誘導毛囊干細胞的分化等。但隨著人們對毛囊干細胞研究的深入及分子層面的研究加強，相信在不久的將來毛囊干細胞一定能定向構建出人們所希望的組織工程皮膚。

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[收稿日期]2008-04-07 [修回日期]2008-06-03

編輯/李陽利