缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因Ｂｃｌ－２

缺血再灌注損傷是各種器官及組織移植過程中導(dǎo)致早期失去功能的最主要原因。近年來，越來越多的研究證實，細(xì)胞凋亡是造成移植物缺血再灌注損傷早期細(xì)胞死亡的主要方式。現(xiàn)將缺血再灌注損傷時細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)以及其調(diào)控機制的相關(guān)研究進展綜述如下。

1細(xì)胞凋亡的概念

細(xì)胞凋亡（Apoptosis），又稱細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，是細(xì)胞生命周期中的重要組成部分。這一概念是1972年由澳大利亞組織病理學(xué)家 Kerr[1]首先提出，Apoptosis一詞本意是花瓣或樹葉從花或樹上掉落或凋落，而Kerr借用它來形象地描述一種特殊類型的細(xì)胞死亡即凋亡。它是一種具有獨特的形態(tài)學(xué)和生化改變的、與壞死截然不同的另一種死亡方式；是一個主動的高度有序的經(jīng)基因嚴(yán)密調(diào)控的一系列酶參與的過程，可見于胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、組織分化及細(xì)胞癌變等過程[2］。

2細(xì)胞凋亡的特點

細(xì)胞凋亡描述的是單個細(xì)胞的死亡，其典型的形態(tài)學(xué)改變是[3]：細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)凝縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松并與胞膜融合；核糖體等聚集，但無結(jié)構(gòu)破壞，染色質(zhì)固縮，密度增高并集聚于核膜周邊，嗜堿性增強，核仁裂解，繼而細(xì)胞膜出泡、內(nèi)陷，將細(xì)胞自行分割成多個具有膜包裹的凋亡小體（apoptosis body）。凋亡小體最后被巨噬細(xì)胞或臨近吞噬細(xì)胞吞噬，或排入體腔如腺腔及血管腔等[4]。整個過程無細(xì)胞質(zhì)的外泄，故不引起炎癥反應(yīng)及周圍組織的次級損傷。而細(xì)胞壞死是細(xì)胞死亡的另一種方式，其特點與細(xì)胞凋亡不同，主要表現(xiàn)為膜通透性增加，細(xì)胞外形不規(guī)則變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核染色質(zhì)位移，細(xì)胞器和核腫脹，溶酶體破壞，細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢，壞死細(xì)胞被巨噬細(xì)胞所吞噬，引起周圍組織不同程度炎癥反應(yīng)。因此細(xì)胞壞死一般是成片發(fā)生的，在形態(tài)上易與細(xì)胞凋亡相區(qū)別。

細(xì)胞凋亡的生化特征主要是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列信號傳遞反應(yīng)，以染色體脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）被激活的核酸內(nèi)切酶有控降解為突出特征。基因組DNA發(fā)生有規(guī)律的不可逆性降解，核小體之間的連接部雙螺旋DNA被特異性鈣離子/鎂離子（Ca2＋/Mg2＋）依賴的DNA內(nèi)切酶斷裂成含180～200 個堿基對（base pair，bp）的多倍寡核小體片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈典型的梯狀(ladder)條帶。利用這一特點，可以檢測凋亡細(xì)胞的存在 ［5-6］。

3缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷時的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

既往普遍認(rèn)為組織I/R損傷后最終必將引起細(xì)胞死亡，即壞死，但近年來的研究表明，細(xì)胞凋亡是在I/R損傷早期的細(xì)胞死亡形式，且在I/R損傷的病理過程中起著重要的作用。

3.1 肝臟I/R損傷與細(xì)胞凋亡：Borghi等[7]觀察了16例臨床原位肝移植術(shù)后細(xì)胞凋亡情況，整個切片肝細(xì)胞凋亡指數(shù)為18.7%，肝被膜下區(qū)為30.4%，小葉中央?yún)^(qū)為14.5%，門靜脈周圍區(qū)10.3%。并指出，肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與冷缺血時間無關(guān)，而與術(shù)后天門冬氨酞轉(zhuǎn)氨酶水平呈正相關(guān)，與血清V因子水平呈負(fù)相關(guān)。故認(rèn)為，肝移植術(shù)后出現(xiàn)較多的細(xì)胞凋亡可能與肝臟I/R損傷有關(guān)。Gao等[8]研究發(fā)現(xiàn)單純冷保存肝16h，未發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，而保存8h及16h后分別予以含氧再灌注1h則肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加，故認(rèn)為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是肝移植I/R損傷造成移植肝失去功能的主要原因。張浩等[9]研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝臟均有肝細(xì)胞凋亡發(fā)生，且呈階段性。在冷灌注保存肝組織中可檢測到bax及Fas，未檢測到Bcl-2，肝移植再灌注后肝組織中可檢測到bax、Fas及Bcl-2。Rentsch等[10]研究也證實隨著冷灌注保存及再灌注時間的延長大鼠移植肝細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加，而且bax表達(dá)增強，而天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3(MACH/FLICE)表達(dá)降低。

3.2 腦I/R損傷與細(xì)胞凋亡：Li等[11]在大鼠局灶性腦缺血模型中，采用凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記—TUNEL（TDT-mediat dTUP nick end labeling）法觀察了缺血10～20min再灌流48h后細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況，結(jié)果表明，人腦中動脈阻斷90～120min后再灌流48h，凋亡細(xì)胞大量出現(xiàn)在梗塞灶的內(nèi)邊緣區(qū)。MacManus等[12]在大鼠全腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，12min缺血后，紋狀體和海馬分別于缺血第1、2天出現(xiàn)梯形DNA電泳條帶，并且隨時間的延長，出現(xiàn)以單體(200 bp)和雙體(400 bp)為主的DNA條帶，大腦皮層于缺血第3天亦出現(xiàn)類似結(jié)果。因此認(rèn)為，全腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷不屬于壞死，而是包含著凋亡機制。Tomingn等[13]證實，在局灶性腦缺血時，神經(jīng)元的凋亡和壞死同時存在。

3.3心臟I/R損傷與細(xì)胞凋亡：Fuss等[14]采用原位末端標(biāo)記(ISEL)和瓊脂糖凝膠電泳證實，在缺血和I/R大鼠心肌有典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變和DNA梯形條帶，認(rèn)為缺血和I/R心肌均可發(fā)生細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞的凋亡與缺血及I/R持續(xù)時間長短有關(guān)。Gottieb等[15]研究發(fā)現(xiàn)兔I/R心肌細(xì)胞呈現(xiàn)DNA梯形條帶及核染色質(zhì)濃縮，而正常或缺血兔心肌細(xì)胞無此現(xiàn)象，提示心肌細(xì)胞凋亡是再灌注心肌損傷的特征之一。Panizo等[16］的研究證實心臟移植術(shù)后的凋亡細(xì)胞與缺血再灌注損傷有關(guān)。

3.4 肺I/R損傷與細(xì)胞凋亡：Stammberger等[17]的研究證實大鼠移植肺的凋亡指數(shù)與冷保存時間無關(guān)，與移植缺血再灌注損傷有關(guān)，且移植物含氧再灌注2h肺細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，其后逐漸降低。Fischer等研究發(fā)現(xiàn)大鼠肺冷保存20min、6h及12h后細(xì)胞死亡率＜2%，而保存18h及24h后細(xì)胞死亡率則分別為11%及27%，細(xì)胞死亡方式主要為壞死。以上時間段冷保存的肺移植后再灌注2h，細(xì)胞死亡方式則發(fā)生變化，6h及12h組約有30%細(xì)胞凋亡，僅有2%的細(xì)胞壞死。而18h及24h組分別有30%及29%的細(xì)胞壞死，僅有1%細(xì)胞凋亡。移植后肺功能檢測的結(jié)果表明其與保存時間及壞死細(xì)胞百分比負(fù)相關(guān)。因此認(rèn)為細(xì)胞凋亡是移植肺缺血再灌注損傷早期細(xì)胞死亡的主要方式之一，對肺功能的影響遠(yuǎn)較細(xì)胞壞死低。

3.5 腎I/R損傷與細(xì)胞凋亡： Burns等[18]通過對11例接受活體供腎及25例接受尸腎的腎移植患者的研究發(fā)現(xiàn)尸腎移植后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于活體供腎，而且尸腎冷保存30h移植后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于冷保存24h以內(nèi)。因此認(rèn)為腎移植術(shù)后的凋亡細(xì)胞與腎缺血再灌注損傷有關(guān)。

4Bcl-2與細(xì)胞凋亡及調(diào)控機制

細(xì)胞凋亡與增殖的動態(tài)平衡是細(xì)胞維系其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境功能平衡及生長發(fā)育最基本的生物學(xué)過程， 細(xì)胞凋亡受自身基因調(diào)控，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來發(fā)現(xiàn)許多基因的表達(dá)與凋亡有關(guān)，且新的凋亡基因不斷被發(fā)現(xiàn)，它們之間存在著復(fù)雜的關(guān)系。目前，對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及調(diào)控機制的研究已成為生命科學(xué)的前沿和熱點，其中Bcl-2基因家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)控倍受矚目。

Bcl-2于1985年由Tsujimoto等研究濾泡性非何杰金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)在染色體轉(zhuǎn)位時可以激活一種基因即Bcl-2基因。Bcl-2編碼蛋白由239個氨基酸殘基組成，分子量26KD，其34～80位氨基酸殘基突變率很高，而兩側(cè)的氨基酸序列相對保守。Bcl-2在進化過程中有高度保守的傾向，Bcl-2蛋白功能也相對保守，從原蟲到人細(xì)胞Bcl-2都有阻斷細(xì)胞凋亡功能。對Bcl-2一級結(jié)構(gòu)進行分析，未發(fā)現(xiàn)典型的信號傳導(dǎo)或跨膜蛋白特異序列，但在其羧基末端發(fā)現(xiàn)了疏水性氨基酸序列。人、大鼠、雞的 Bcl-2蛋白近羧基端有1段19個氨基酸羧基組成的疏水區(qū)，在此疏水區(qū)外側(cè)僅有兩個帶電殘基，這兩個殘基作用是將19個氨基酸殘基錨定在細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)上。突變研究證明，Bcl-2蛋白疏水區(qū)插入膜性結(jié)構(gòu)中，從而使Bcl-2分子球形結(jié)構(gòu)伸向胞質(zhì)中，并證實這種插入對Bcl-2分子發(fā)揮阻止細(xì)胞凋亡有重要作用[19]。Bcl-2蛋白可表達(dá)于正常細(xì)胞的激活和發(fā)育過程中，在成熟組織中亦有表達(dá)，在走向凋亡的細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。Bcl-2蛋白可存于免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等正常組織中，也可存在于人體多種形態(tài)的腫瘤組織中。

目前已發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類：①象Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如哺乳動物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、線蟲Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等；②具有促進凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri[21]。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的機理尚不完全清楚，目前認(rèn)為的機理有以下幾種：

①Bcl-2蛋白的細(xì)胞定位：Bcl-2蛋白是一種與細(xì)胞器特別是線粒體膜相關(guān)的蛋白，它主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，其C-末端一段疏水氨基酸對其功能非常重要，改變其中的氨基酸可使其生物活性大大降低[20]；②Bcl-2和Ca2+：Bcl-2蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有分布，高濃度的Bcl-2蛋白可以抑制正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，因此認(rèn)為Bcl-2干擾Ca2+釋放可能是Bcl-2抗凋亡機制之一；③Bcl-2和細(xì)胞轉(zhuǎn)運：Bcl-2通過直接或間接地與細(xì)胞信號傳遞蛋白作用而調(diào)控細(xì)胞凋亡。最新研究表明，Bcl-2可以改變P5和Cdc2及CDK2細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的核-胞漿轉(zhuǎn)運。Bcl-2與編碼P53基因的共表達(dá)可延緩P53誘導(dǎo)的凋亡，從而阻斷P53誘導(dǎo)的凋亡和生長停止；④Bcl-2和氧自由基：Bcl-2在線粒體的大量分布，提示可能與氧代謝有關(guān)，氧化代謝過程中可以產(chǎn)生自由基，自由基又是凋亡誘導(dǎo)劑之一，有研究表明，細(xì)胞在接受多種凋亡誘導(dǎo)刺激后Bcl-2表達(dá)大量增加，并且能減輕自由基造成的結(jié)構(gòu)破壞，Pau1等發(fā)現(xiàn)Bcl-2能阻止脂質(zhì)過氧化物的形成，抑制氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Bcl-2的抗氧化和抑制自由基產(chǎn)生作用，是其阻止細(xì)胞凋亡的另一機制；⑤Bcl-2相互作用蛋白：對Bcl-2結(jié)合蛋白和Bcl-2同源蛋白的研究，使人們對Bcl-2抑制凋亡的機制有了新的認(rèn)識。Bcl-2和Bax既可以以同源二聚體形式存在，也可以形成異源二聚體。Bcl-2、Bax和Bcl-x三者形成了一個凋亡調(diào)控系統(tǒng):當(dāng)Bax同源二聚體形成，便誘導(dǎo)凋亡。隨著Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，越來越多的Bax二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而“中和”了Bax-Bax誘導(dǎo)凋亡的作用，即Bcl-2與Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。而當(dāng)Bcl-xs存在時，優(yōu)先與Bcl-2形成異源二聚體，使游離Bax得以形成同源二聚體誘導(dǎo)凋亡。這一模型也許可以解釋為什么Bcl-2表達(dá)并不一定抑制某些細(xì)胞的凋亡作用。另外Bad與Bcl-x1形成異源二聚體，可阻止Bcl -x1對凋亡的抑制，而Bad與Bcl-2的結(jié)合不能阻止對凋亡的抑制。當(dāng)Bad與 Bcl-x1形成穩(wěn)定的異源二聚體后，使原來的Bax-Bcl- x1解體，將Bax置換出來，形成Bax同源二聚體，啟動凋亡。Bax、Bad、Bcl-x1模式與Bax、Bcl- xs、Bcl -2模式極為近似，兩者共同點為Bax最終導(dǎo)致凋亡。Bcl-2和Bcl-x1通過與Bax結(jié)合抑制凋亡，Bcl-xs和Bad通過與Bcl-2和Bcl-x1的結(jié)合置換Bax，啟動凋亡。這一模式很可能是Bcl-2家族作用于凋亡過程的基本模式[21]；⑥抑制胞膜磷脂酰絲氨酸早期重分布：凋亡中的一個重要現(xiàn)象就是凋亡細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸 (Phosphatidylserine，PS)的暴露。正常情況下PS位于胞膜內(nèi)側(cè)，凋亡早期PS廣泛易位至胞膜外側(cè)從而使吞噬細(xì)胞得以識別凋亡細(xì)胞。由于胞膜PS的早期重分布是凋亡的一個共同特征，而Bcl-2恰恰能夠抑制PS的這種變化，從而提示Bcl-2可能通過抑制PS的外在化而阻止凋亡[22]；⑦通過參與信號傳遞而抑制細(xì)胞凋亡：R-RasP23、R-RasP21、Raf-1、NO等都是重要的信號傳導(dǎo)分子，同時也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，這些分子或可與Bcl-2結(jié)合，或可調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)，Bcl-2參與這些分子相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，通過影響這些通路而抑制細(xì)胞凋亡。近年來人們又發(fā)現(xiàn)Bcl-2可參與IL-2R介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，使抗原特異性T細(xì)胞免受γ射線和地塞米松誘導(dǎo)的凋亡。

5展望

缺血再灌注損傷是一種受多方面因素影響的病變過程，這一病變過程可引起細(xì)胞凋亡，同時細(xì)胞凋亡又是缺血再灌注損傷造成組織、器官失去功能的主要原因。由于細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，因此，為我們研究減輕缺血再灌注損傷、提高移植物的成活率開辟了一條新的治療途徑。在調(diào)控細(xì)胞凋亡的眾多基因中，Bcl-2基因家族在抑制細(xì)胞凋亡方面起到了重要作用，通過調(diào)高抑制凋亡基因的表達(dá)，或者阻斷凋亡信號的傳導(dǎo)途徑，均可達(dá)到減輕甚至消除缺血再灌注對組織、器官的損傷作用。隨著研究的不斷深入，有望尋找到更加有效的防治缺血再灌注損傷的藥物。

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[收稿日期]2008-03-31[修回日期]2008-06-04

編輯/李陽利