核酸疫苗在水產養殖業中的應用研究現狀

近年來隨著人們對水產品需求量的增加，水產養殖業得到了快速的發展。但大規模高密度養殖造成的水環境污染，致使水產病害日趨嚴重，特別是病毒性疾病造成的損失更是驚人。目前，養殖者大多使用化學合成或抗生素類藥。由于藥物殘留、誘變抗藥菌株及水體污染等副作用，導致了我國水產品在出口時遇到種種障礙，嚴重阻礙了養殖業的發展。因此，采用疫苗預防水產動物疾病，成為各國研究者關注的重要內容。

1核酸疫苗的發現

魚用疫苗可分為三種類型：第一種為減毒及滅活疫苗；第二種為重組亞單位疫苗和合成多肽疫苗；第三種是核酸疫苗。第一、二種疫苗雖然在生產實踐中得到了較大程度的應用，然而在生產成本、效價穩定性、保護力等方面還存在一定的問題。1990年，Wolff等發現將質粒脫氧核糖核酸（裸露的脫氧核糖核酸）注射給小鼠能引起外源基因的長期表達；Ulmer等進一步證實，將病毒蛋白基因注射給動物能引起免疫反應。由此，誕生了脫氧核糖核酸免疫技術，使得核酸疫苗成為繼減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗和重組多肽疫苗之后的又一新型疫苗，譽為第三次疫苗革命。

有關魚類核酸疫苗的報道最早見于1996年。Anderson等和Gomdz-Chiari等的實驗分別證明了向魚體注射帶病基因的DNA疫苗能引起魚體產生免疫反應。Anderson等給虹鱒注射含IHNV病毒糖蛋白基因的質粒脫氧核糖核酸，使虹鱒對IHNV產生了抗性。魚類DNA疫苗的研究工作起步較晚，目前主要集中在鮭、鱒魚類的IHNV、VHSV、桿狀病毒（SVCV）、鯉春病毒（SHRV）等傳染性病毒病的防治上。但已經取得了令人鼓舞的成就。挪威已批準使用一種可注射的、用病毒蛋白VP3制作的抗IPN疫苗。該疫苗對入海前的小鮭和養殖場中突發的鮭魚病有防御作用。IHHNV疫苗也已通過G蛋白獲得，該疫苗在實驗室和現場實驗中均獲得了良好的防御效果。

2核酸疫苗的免疫機理

魚類的免疫防御包含兩道防線，第一道防線是魚體的非特異性免疫系統，包括物理屏障（如粘膜表層和皮膚）、多種白細胞（如單核細胞、巨嗜細胞、粒細胞和非特異性細胞毒細胞等）和免疫活性物質（如溶菌酶、干擾素、C-反應蛋白、鐵傳遞蛋白、凝集素及補體等），這種非特異性免疫系統對魚類免疫防御起著關鍵作用；第二道防線為特異性免疫系統，分為體液免疫和細胞免疫兩種。

核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，由含保護性抗原基因的質粒構成，導入機體后被宿主細胞攝取、表達、加工并提呈給免疫系統誘導特異性體液免疫和細胞免疫。

2.1核酸疫苗誘導的體液免疫

核酸疫苗能夠誘導魚體內抗原特異性免疫蛋白的產生。Kanellos等（1999）將含有巨細胞病毒啟動子（CMV）和許多基因的質粒（PCMV-LacZ）通過肌肉接種到金魚體內，7d后便在其體內檢測到了β-半乳糖苷酶的存在；盡管免疫幾周后抗體形成細胞的數量快速衰減，但血清中抗體濃度能維持3～8周的高峰期。Boudinot等（1998）以含有病毒性出血敗血癥病毒（VHSV）的G蛋白基因的質粒注射虹鱒，23d后在其體內檢測到了蛋白抗體的存在。在最初的DNA疫苗試驗中，只在免疫虹鱒體內檢測到少部分的血清發生轉化（2/15），而之后的試驗則在免疫魚體內檢測到了較高的抗體水平。

2.2核酸疫苗誘導的細胞免疫

動物淋巴細胞增殖試驗證明，當從DNA疫苗免疫的魚體內分離隔離出來腎臟白細胞，并在免疫后不同時間內注入魚體時，該腎臟白細胞仍能獲得免疫活性。1998年Boudinot等采用真核表達載體pCDNA以及巨細胞病毒（CMV）啟動子分別構建了VHSV和IHNV糖蛋白基因的DNA疫苗，單獨或聯合給虹鱒成魚進行肌肉注射，結果發現注射45天后仍能在肌細胞里檢測到質粒脫氧核糖核酸，在疫苗注射部位還檢測到了Mx蛋白和主要組織相容性抗原（MHC）Ⅱ類分子的RNA。Mx蛋白是一種干擾素誘導因子，其檢出說明魚體產生了抗病毒的非特異性免疫反應。MHCⅡ類分子只在巨噬細胞或樹突狀細胞等專門的抗原呈遞細胞表面存在，二者的生成說明DNA疫苗對魚體非特異性免疫和細胞免疫均具有誘導作用。此外，抗原蛋白的表達還能誘導淋巴細胞分化出細胞毒素T淋巴細胞（CTLs），CTLs能殺死病原細胞或通過非細胞溶解方式抑制病原菌感染。

3 核酸疫苗的構建

構建核酸疫苗的關鍵是保護性抗原基因的篩選和載體的選擇。

3.1保護性抗原基因的篩選

保護性抗原基因的篩選是通過比較不同保護性抗原編碼基因在被免疫對象體內的表達與誘導免疫保護力的情況，篩選有效的基因作為目的基因。其篩選方法有：共價血清免疫篩選法；表達文庫免疫篩選法；直接將亞單位疫苗或合成多肽疫苗的編碼基因作為候選基因等。

3.1.1共價血清的免疫篩選

病原微生物的表達型文庫可用特異性抗體-免疫學探針進行篩選。通過影印法將文庫轉移到硝酸纖維素膜上，用特異性抗體在膜上進行免疫結合反應，再與放射性標記的二抗結合，進而找出帶有示蹤訊號的斑點。或通過酶標抗體與底物顯色篩選目的克隆。

3.1.2表達文庫免疫篩選法（ELI）

表達文庫免疫篩選法是用病原的基因組表達型文庫逐級分組免疫動物，通過攻毒實驗獲取候選基因或候選基因片段的一種方法。Barry等最先報道ELI，這種方法常被用來篩選寄生蟲的候選基因。Alberti等用克氏錐蟲（Try-panosoma cruzi）的表達文庫免疫小鼠，結果在小鼠體內檢測到特異性的IgG。Piedrafita等用同樣的方法從利氏曼原蟲（Leishmania major）基因組表達文庫中最終篩選到五個具有保護力的克隆，Melby等則篩選到杜氏利氏曼原蟲（Leishma-nia donovani）的組蛋白和核糖體蛋白能夠誘導動物機體產生病原特異性的T細胞免疫應答反應。

不同于共價血清免疫篩選，表達文庫免疫篩選既能誘導體液免疫又能誘導細胞免疫，并且在篩選過程中細胞毒性T淋巴細胞的靶位不會被丟失。ELI在不清楚抗原性靶位研究背景的情況下，可以篩選到病原基因組中的每一個可能的基因。

3.1.3其他篩選方法

直接將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因。病毒的保護性免疫應答是由包裹病毒的表面多肽或從病毒表面突起穿過脂質囊膜的多肽激發的，可將編碼這些免疫原的基因直接作為候選基因。另外，毒力是病原微生物致病性的根本原因，誘導針對主要毒力抗原決定族的免疫力是建立免疫保護的另一種重要手段。

3.2核酸疫苗載體設計

魚類采用哺乳動物表達載體，如pcDNA3.1（+/-）作為表達外源基因的質粒骨架，標準載體中的轉錄控制序列（啟動子、增強子、內含子、Poly-A信號等）在水產動物中同樣有效。載體的屬性，如不相關的Th表位，CpG motif，共線性表達的細胞因子或共刺激分子都通過核酸疫苗體現。如將小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）基因與抗原編碼基因構建在同一個質粒載體上免疫鯽（Carassius auratus），誘導鯽產生細胞介導的免疫應答。

啟動子是驅動外源基因在宿主細胞中表達的主要元件。在各種各樣的啟動子中，以人巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）早期啟動子效果最好，使用也最廣泛。這種啟動子能使外源基因在有鰭魚類中高水平表達。為了構建水產動物核酸疫苗安全而高效的表達載體，Gómez-Chiarri等比較了CMV與兩種魚源啟動子—鯉β-肌動蛋白和花（Fundulusheteroclitus）乳酸脫氫酶β-啟動子驅動螢火蟲熒光素酶基因在鮭（Salmo salar）肌肉中的表達情況。結果CMV和β-肌動蛋白啟動子都能使熒光素酶基因高水平表達，β-肌動蛋白啟動子較CMV效果稍差，但差異不顯著。β-肌動蛋白啟動子在很多組織和細胞中都誘導到外源基因較高水平的表達，因而成為水產動物核酸疫苗載體構建過程中病毒啟動子的安全而高效的替代元件。

4核酸疫苗的免疫接種方法

核酸免疫接種途徑包括直接注射裸DNA、基因槍導入法和浸泡等。

4.1肌肉注射

核酸疫苗主要是通過肌肉注射接種的。雖然注射免疫勞動強度大并會對魚體造成很大脅迫，但其免疫效果往往卻是最好的。肌肉注射能誘導疫苗基因的強而持久的表達。

4.2基因槍免疫

通過基因槍將少量核酸疫苗導入皮下可以有效地誘導免疫應答。其原因是皮下存在大量的APC。免疫反應發生時APC被轉染并表達抗原蛋白，從而表現出極高的抗原呈遞效率。Tucker等以綠熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）為報告基因評估基因槍免疫時不同psi對魚體損傷程度及對接種效率的影響，結果200psi的綜合效果最好。Hansen等的研究也表明基因槍能夠直接將包被核酸疫苗的微顆粒導入靶細胞，而肌肉注射時大多數核酸并沒能到達靶細胞。

4.3浸泡和超聲波相結合法

給虹鱒幼魚接種VHSV核酸疫苗，以GFP作為報告基因比較浸泡-短脈沖超聲導入法與DOTAP脂質體共轉染導入法的免疫效果，結果以前者的GFP表達量為高，并能使機體獲得對VHSV的保護力。可見，短脈沖低強度超聲導入是一種針對魚苗的非常實用的接種方法。

4.4弱毒株介導的免疫接種

細胞內寄生的弱毒株不僅被用于預防其本身的感染，還可作為異源抗原的載體，構建成攜帶核酸疫苗的活疫苗。通過口服形式即可以穩定、持續、高效地表達外源抗原，獲得相應的細胞免疫和體液免疫。單核細胞增生性利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）能夠感染魚是一細胞系如鯉上皮瘤細胞系（EPC），胚胎細胞系（A2），黑色素瘤細胞系（PSM），且其一旦從宿主細胞的吞噬體中逃逸出來，其本身的actA啟動子就會被激活并表達L.monocytogenes特異性的抗菌素細胞溶解酶，致使菌體發生自溶，并可使轉化到菌體中的核酸疫苗直接進入到宿主細胞質中。用轉化有pAct-gfp的L.monocytogenes感染這些細胞系，24h后就可在這些細胞的胞質溶膠中檢測到綠熒光蛋白的表達，更重要的是actA啟動子在低溫下也具有活性。可見，L.monocytogenes既可介導溫水魚又可介導冷水魚的疫苗接種。

4.5魚類胸腺介導的免疫接種

胸腺是魚類重要的淋巴器官。魚類的胸腺上皮細胞具有吞噬功能，且胸腺中存在有大量的巨噬細胞、粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等，故胸腺上皮細胞能夠有效地呈遞抗原。抗原呈遞細胞介導的核酸免疫能夠產生高效的免疫保護，如以電脈沖法將肥頭帶絳蟲（Taeniacrassiceps）囊尾蚴的cDNA表達文庫轉化到巨噬細胞，并以這樣的巨噬細胞進行免疫接種，能夠產生了高的保護力，同時受免動物體內出現抗原特異性脾細胞增殖反應；用編碼皰疹單一病毒兩個糖蛋白的基因構建的核酸疫苗體外轉染樹突狀細胞，并以這樣的細胞為免疫原進行免疫，也誘導到高水平的免疫保護力。更重要的是Maloy等將核酸疫苗直接注射到哺乳動物的外周淋巴結中，可以使免疫效果增強100～1000倍，并誘導強的CTL反應。

5核酸疫苗的安全性

核酸疫苗還有一些不完善的地方，如抗DNA抗體、免疫耐受、自身免疫、過敏反應、局部注射部位損傷、炎癥反應，全身性組織毒性和遺傳及繁殖毒性等。對于DNA可能會整合到宿主細胞的染色體上而造成插入突變的問題，但到目前為止，完成的諸多研究并未發現有插入突變的現象，其頻率甚至比自發突變發生的頻率還要低100倍。在魚用疫苗的應用試驗上至今還沒發現質粒整合入宿主染色體基因組現象的發生，質粒DNA在魚體內會緩慢降解，用ELISA免疫印跡放射免疫分析DNA免疫鼠，均未檢測到DNA抗體，未造成動物的自身免疫性疾病，也不隨卵和精子傳入子代魚體內，它隨生物鏈進入其他魚種和動物體內時會失活，而且對環境的污染很小，因此其危險性遠低于現用的其他疫苗。外源DNA一般來自于細菌培養物，其質粒載體上常含有抗生素基因，在動物體內是否表達并產生作用、制品中是否含有內毒素、質粒是否以超螺旋形式存在等，也都是應該考慮的安全性問題。

6魚用核酸疫苗的研究展望

早期核酸疫苗的研究主要以哺乳動物為模型，后來發現魚類細胞同樣能夠有效地表達由真核表達載體攜帶的外源蛋白基因，誘導產生體液免疫反應而生成抗體，也能產生細胞介導的免疫反應，因此開始將核酸疫苗應用于魚類。但由于魚類免疫系統的研究還不夠深入，魚類病原抗原基因的研究工作也還不多，所以魚用核酸疫苗的作用機制和抗原基因的分離還有待于進一步探索。在國內除對草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒有一定的研究外，魚類主要病原表面抗原的分子生物學基礎研究還亟待加強。此外，優化核酸疫苗效率、降低疫苗生產成本、研究非注射方式接種，使之適合規模化生產等，都是影響其應用前景的重要因素。此外，發展能抑制多種病原體的多價疫苗十分重要。相信未來將會制備和生產更多的高效安全、使用方便的核酸疫苗，促進我國水產養殖業的發展。