海藻糖對日本對蝦部分免疫指標的影響

摘要：以日本對蝦（Penaeus japonicus）為實驗對象，測定海藻糖對日本對蝦部分免疫指標的影響。結果表明：注射海藻糖后，日本對蝦血清的凝血活性增強，注射后96h，0.4%濃度組凝血活性達到最高，為對照組的2.5倍；注射后48h到96h，超氧化物歧化酶活性維持在一個較高的水平（p<0.05）；酸性磷酸酶活性在注射48h時最高，明顯高于對照組；溶血素活性在注射海藻糖后有明顯增強，注射后48h，0.4%濃度組的活力達到最高，而0.2%濃度組分別在24h和96h時，溶血素活力達到峰值；注射海藻糖對血清抗菌活力基本沒有影響，說明海藻糖對日本對蝦的抗菌活力沒有增強作用。

關鍵詞：海藻糖；日本對蝦；免疫指標

海藻糖作為一種天然的糖類，由Wiggers于1932年從黑麥的麥角菌中首次提取出來，

海藻糖在自然界中廣泛分布，主要是在低等植物、藻類、細菌以及一些無脊椎動物中。特別是在酵母、霉菌以及蘑菇等真菌中，海藻糖含量可達干重的15%以上。自海藻糖發現以來對其化學性質、生理功能、作用機理、代謝途徑等已進行了較為深入的研究，其分子生物學的研究也漸漸興起。大量證據表明，海藻糖具有保存生物活力的特殊功能，它獨特的對生物的抗脫水、抗冷凍、抗高滲的保護作用使其作為一種天然的非特異性生物保護物質而倍受關注。離體試驗表明海藻糖能保護生物膜、蛋白質的結構并能保持逆境下的酶活性，同時，外源海藻糖同樣對生物體有保護作用。由于海藻糖具有這些獨特的生物學功能，它已在許多方面得以應用，可作為食品工業的一種添加劑和甜味劑，使干燥食品在得水后保持原有的色、香、味；也可作為醫藥工業的非特異性生物制品和生化藥品保護劑，使其在常溫下保存，從而降低運輸與儲存費用；另外，在農業研究中可利用現代分子生物技術培育表達海藻糖的轉基因作物，提高農作物的抗旱、抗凍等抗逆性能。在不同生物中，海藻糖的生物合成途徑并不完全相同，目前至少已發現3種途徑：以葡萄糖為底物的海藻糖合成途徑、以淀粉為底物的海藻糖合成途徑和以麥芽糖為底物的海藻糖合成途徑。有關海藻糖代謝途徑的研究已取得了較多成果，也相繼從多種微生物中克隆了海藻糖合成的相關基因。

海藻糖對動物免疫功能影響的研究未見報道，對水產類養殖動物免疫功能影響的研究也未見報道，本研究以日本對蝦（Penaeusjaponicus）為實驗對象，研究海藻糖對其部分非特異性免疫指標的影響，進而探究海藻糖的不同應用方法對水產養殖類動物免疫功能所產生的影響，最終能找到海藻糖提高水產養殖動物免疫功能的最佳應用方式，為增強水產養殖動物免疫功能開辟一條綠色通道。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗用日本對蝦購自大連市水產品批發市場，生物體長為8.5±0.5cm，體色正常，健康活潑。實驗前于實驗室中常規方法暫養7d，保證實驗前活力狀況良好。海水鹽度為25±0.3，pH為8.2±0.2，溫度為17.5±0.5℃，連續充氣，日換水2次，日換水量為1/2，投喂市售對蝦配合飼料。

1.2實驗方法

1.2.1血清樣品制備

實驗設置3個實驗組，每組分別注射0.2%、0.4%、0.8%的海藻糖溶液（用0.9%的生理鹽水配制），以注射生理鹽水的日本對蝦為對照組，注射量均為0.1mL/尾，注射方法為尾節肌肉注射，實驗設置三個平行。

注射后分別在24h、48h、72h、96h和120h取血液，采血方法為圍心腔采血。用1mL注射器吸取安氏液潤洗，每次每個處理取4～5尾對蝦的血液，注入離心管（經安氏液潤洗），搖勻，放入冰盒保存，然后于2500r/min，4℃離心10min，棄去沉淀，上清液于-20℃冰箱中保存，用于各個非特異性免疫指標的測定。

1.2.2非特異性免疫指標的測定

1.2.2.1凝集活性的測定

采用連續倍比稀釋法測定日本對蝦血清凝集活性。

1.2.2.2超氧化物歧化酶活性測定

采用鄰苯三酚法測定超氧化物歧化酶活力，按照劉恒的方法進行。

1.2.2.3酸性磷酸酶活性的測定

ACP活性的測定以磷酸苯二鈉為底物，用紫外分光光度法測定，按照劉恒的方法進行。

1.2.2.4抗菌活性的測定

以大腸桿菌為底物，參照王雷等的方法進行。

1.2.2.5溶血素活性的測定

參照管華詩的方法進行。

1.3數據處理

實驗結果進行統計處理。數據結果均為平均數±標準誤差（mean±SDE）；用t-檢驗法對組間數據進行差異性顯著分析，P<0.05，認為是差異顯著，P<0.01，認為是差異極顯著。

2結果與分析

2.1凝集活性的測定

從圖1中可以看出對照組中日本對蝦血清凝集活性基本未發生變化，注射海藻糖的實驗組血清凝集活性總體呈先升高后降低的趨勢，其中注射0.2%和0.4%濃度的海藻糖在96h時都達到峰值。注射0.4%濃度的海藻糖對日本對蝦血清凝集活性的影響比較大，高于其它兩個濃度，在96h時是對照組的2.5倍.

2.2超氧化物歧化酶活性的測定

從圖2中可以看出未注射海藻糖的對照組，日本對蝦超氧化物歧化酶的活性基本未發生變化，注射海藻糖的實驗組對其影響較大，0.2%濃度海藻糖從72h到96h使日本對蝦的超氧化物歧化酶維持在一個較高的水平（p<0.05），0.4%濃度海藻糖從48h到96h使日本對蝦的超氧化物歧化酶活性維持在一個較高的水平（p<0.05），而0.8%濃度的海藻糖只是在48h使日本對蝦超氧化物歧化酶達到較高的水平，之后迅速下降。

2.3酸性磷酸酶活性的測定

從圖3中可以看出未注射海藻糖的對照組，日本對蝦酸性磷酸酶的活性基本未發生變化，0.2%濃度的海藻糖使該酶的活性在48h時達到峰值，隨后時間與對照組相同都趨于穩定狀態，0.4%和0.8%濃度的海藻糖雖然也使該酶的活性增強但并不穩定，在96h到120h時酸性磷酸酶活性突然升高（p<0.05）。

2.4抗菌活力的測定

從圖4可以看出，各實驗組與對照組無明顯變化，說明這三個濃度的海藻糖對日本對蝦血清抗菌活力沒有增強作用。

2.5溶血素活性的測定

從圖5可以看出，實驗組從24～120h的血清溶血素活性值均高于對照組，注射0.2%濃度的海藻糖在24h和96h時的溶血素活性值明顯高于對照組（p<0.05），注射0.4%濃度的海藻糖在48h時的溶血素活性值明顯高于對照組（p<0.05）。結果表明，注射海藻糖對日本對蝦血清溶血素活力有明顯的促進作用。

3討論

凝集素活性是無脊椎動物體腔液與血液非特異性免疫的一個重要指標，凝集素有助于機體清除入侵的微生物，研究免疫增強劑對其影響效果對無脊椎動物的免疫具有重要的意義。凝集素大多數為糖蛋白，海藻糖對凝集素的合成不僅提供物質基礎，同時還提供了能量來源，增強了日本對蝦血清的凝集素活性。本研究結果表明，注射海藻糖后，日本對蝦血清凝集活性增強，在96h時各實驗組都達到峰值，因而認為，注射海藻糖可以增強日本對蝦血清凝集活性。

超氧化物歧化酶（SOD）的水平與對蝦的免疫功能有關。本研究結果表明，0.2%濃度海藻糖在72～96h使日本對蝦的超氧化物歧化酶維持在一個較高的水平（p<0.05），0.4%濃度海藻糖在48～96h使日本對蝦的超氧化物歧化酶維持在一個較高的水平（p<0.05）。因此認為注射海藻糖對日本對蝦的超氧化物歧化酶活性具有明顯的增強作用。

劉樹青等對中國對蝦腹腔注射1%的海藻多糖和蟲草多糖后，堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶（ACP）活性均有顯著升高。說明海藻多糖和北蟲草多糖作為免疫藥物能夠增強中國對蝦的免疫功能。本研究結果表明，注射0.4%和0.8%濃度的海藻糖在96～120h時酸性磷酸酶活性與對照組相比升高趨勢明顯（p<0.05），注射0.2%濃度的海藻糖后從48h開始，酸性磷酸酶活性值高于對照組，之后隨著時間的延長，試驗組血清的酸性磷酸酶活性值一直高于對照組（p<0.05），結果表明，注射海藻糖后可以顯著提高日本對蝦血清的酸性磷酸酶活性。

王雷等（1995）認為抗菌活力可以作為免疫指標。Jenny等（2000）報道，血清的抗菌活力被看作是健康評價的標準，是衡量對蝦健康狀況的指標。但本試驗注射海藻糖后，日本對蝦血清的抗菌活力與對照相比基本沒有明顯變化。因此，海藻糖對日本對蝦血清的抗菌活力是否有作用還需要作進一步的研究。

溶血素是對蝦血清中能夠溶解脊椎動物血細胞的物質，是非特異性免疫因子之一，其作用代表了蝦體對異物分子識別的能力。劉巖等（2000）用聚甘露糖醛多糖作為免疫藥物，對中國明對蝦進行注射刺激后，發現血清中的溶血活性有顯著提高。本研究結果表明，注射0.2%濃度的海藻糖在24h和96h時的溶血素活性值明顯高于對照組（p<0.05），注射0.4%濃度的海藻糖在48h時的溶血素活性值明顯高于對照組（p<0.05）。因此認為注射海藻糖對日本對蝦的溶血素具有一定的誘導性，外源刺激物的誘導可以使血淋巴中的溶血素活性有所提高。

本文研究了注射三種濃度海藻糖后測定日本對蝦血清幾種酶活因子的變化情況，旨在探討海藻糖應用于對蝦增強其免疫能力的可行性。結果表明， 海藻糖可以提高日本對蝦血清的凝血活性、超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性和溶血素活力，尤其是超氧化物歧化酶活性、酸性磷酸酶活性、溶血素活力與對照組相比有顯著的提高，說明注射海藻糖對增強對蝦的非特異性免疫能力可產生積極的作用。目前對蝦體液免疫的研究主要集中在幾種酶活因子上，至于這幾種酶活因子之間的關系還需要作更深層次的研究。