ＴＧＦ－β_１基因－５０９Ｃ／Ｔ單核苷酸多態性與病理性瘢痕易感性研究

[摘要]目的：探討轉化生長因子β1(TGF-β1)基因-509C/T多態性與中國漢族人群病理性瘢痕的相關關系。方法：采用聚合酶鏈反應-反向點雜交、DNA直接測序方法檢測了155例病理性瘢痕患者與120名正常對照的TGF-β1基因-509C/T多態性位點的基因型。結果：病理性瘢痕患者的C等位基因頻率明顯高于正常對照組(χ2=4.676，P=0.031)。病理性瘢痕患者的C/T、T/T基因型頻率與正常對照組相比差異無統計學意義(χ2值分別為0.763和1.376;P值分別為0.382和0.241)，而病理性瘢痕患者的C/C基因型頻率明顯高于對照組(χ2=5.493，P=0.019)。提示C/C基因型者患病理性瘢痕的風險性明顯高于C/T、T/T基因型者(OR=2.041，95%CI:1.116～3.73)。結論：TGF-β1基因-509位點C等位基因及C/C基因型可能是病理性瘢痕的易感因素。

[關鍵詞]病理性瘢痕；TGF-β1基因；多態性；遺傳易感性

[中圖分類號]Q813[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）08-1170-03

TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in Han Nationality of Chinese population

ZHUO Yang，ZENG Xing-ye，ZHOU Xue-xue，HUANG Da-dao，PAN Ruo-wang，CAO Xiao-en

（Department of Surgery，the 118th Hospital of PLA，Wenzhou 325000，Hangzhou，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the relationship between TGFβ1-509C/T polymorphism and susceptibility to abnormal scar in a southern Chinese population.MethodsThe TGFβ1-509 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 155 patients with abnormal scar and 120 unrelated healthy controls. ResultsThe frequency of the TGFβ1-509 C allele among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4.676，P=0.031). The C/T and T/T genotype distribution among abnormal scar patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=0.763and 1.376; P=0.382 and 0.241， respectively). However， the C/C genotype frequency among abnormal scar patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.493，P=0.019). The TGFβ1-509 C/C genotype significantly increased the risk for developing abnormal scar，compared to the combination of C/T and T/T genotypes，with the odds ratio(OR) of 2.041， (95%CI: 1.116～3.731).ConclusionTheTGFβ1-509 polymorphism may play a role in susceptibility to abnormal scar.

Key words: abnormal scar; TGFβ1 gene ; polymorphism; genetic susceptibility

瘢痕形成是高等哺乳動物創傷愈合的自然結局，但瘢痕異常增生則會產生病理性瘢痕，特別是發生于頭頸部者可造成面容畸形、器官移位和功能障礙，尤其是對于患者心理方面造成的影響常會嚴重干擾其正常工作和生活。因而，研究瘢痕形成與增生的機理及其防治措施，是目前醫學整形美容領域內函待解決的問題之一。

TGF-β1基因是目前較為關注的與病理性瘢痕相關的基因之一，分子生物學研究表明TGF-β1存在著基因變異及基因多態性，而關于TGF-β1基因多態現象與病理性瘢痕的關系鮮見報道，為此，我們從分子遺傳學角度探討TGF-β1基因-509C/T多態性與浙江地區漢族人群病理性瘢痕發病風險的關系， 以便深入地， 多層次的解析病理性瘢痕的分子生物學機制。

1對象和方法

1.1 研究對象：病理性瘢痕患者和正常對照人群均為浙江地區居民。病理性瘢痕患者均經本院臨床及病理診斷證實，共155例，其中男96例、女59例，年齡10～56歲，平均年齡27.6歲，病變位于頸肩、胸部、腋下及上下肢關節等部位，病史5個月～12年。正常對照為有外傷史而無增生性瘢痕或病理性瘢痕產生的健康居民，共120例，其中男63例、女57例，年齡13～58歲，平均年齡28.4歲。用于基因分析的DNA全部來源于研究對象的外周靜脈血，血樣本用枸櫞酸鈉抗凝，置于-80℃保存備用。

1.2 聚合酶鏈反應-反向點雜交（PCR-RDB）

1.2.1基因組DNA提取：采用北京賽百勝生物技術有限公司的基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特異性寡核苷酸）探針設計：應用Primer Premier5.0設計探針，氨基標記，探針序列分別為：NH2-5′- CTTCCATCCCTCAGGTGTCC-3′；NH2-5′- CTTCCATCCTTCAGGTGTCC -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反應：用于擴增TGF-β1基因-509位點的引物5′端標記了非同位素檢測介質Biotin，引物序列為：Bio-5′- CAGACTCTAGAGACTGTCAG -3′；Bio-5′- GTCACCAGAGAAAGAGGAC -3′，由上海生工生物公司合成。反應在PE-480型擴增儀(美國PE公司)上進行。在50μl反應總體積中，含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎國生物公司)。熱循環參數：94℃熱啟動5min后，94℃40sec，55℃1min，72℃/2min；共35個循環 72℃延伸 5min。取3μl擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，紫外透射儀下觀察結果。

1.2.4 雜交：固化上寡核苷酸探針的膜條連同40μlPCR產物加入含5ml2×SSC～0.1%SDS的試管中，100℃水浴變性7min，置雜交儀中42℃雜交3～6h；然后放入42℃預熱的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；將膜條轉入含2.5U辣根過氧化物酶連鏈酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS試管中，室溫反應15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，將膜條轉入20ml顯色液[19ml0.1mol/L檸檬酸鈉(pH5.0)中加30%過氧化氫3μl和0.1mg/mlTMB]中避光顯色5～15min，期間觀察、記錄結果。

1.3 為檢驗反向點雜交結果的正確性，隨機抽取15例PCR擴增產物送上海生工生物公司測序。

1.4 統計學處理：應用SPSS10.0統計軟件包處理數據，采用χ2檢驗分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異，并計算表示相對風險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidenceinterval，CI)。

2結果

根據我們設計的方案，雜交結束后膜條上格顯示藍紫色斑點為C/C基因型，中格顯示藍紫色斑點為T/T基因型，而上、中全部顯示為C/T基因型，下格為空白對照，無斑點顯示（圖1）。病理性瘢痕組和正常對照組TGF-β1基因多態性比較如表1所示。

病理性瘢痕組的C等位基因頻率(49.7%)明顯高于正常對照組(40.4%，χ2=4.676，P=0.031， P＜0.05)。病理性瘢痕組的C/T、T/T基因型頻率分別為43.9%和28.4%，與正常對照組相比差異無統計學意義(χ2值分別為0.763和1.376；P值分別為0.382和0.241)。而病理性瘢痕組的C/C 基因型頻率為27.7%，明顯高于正常對照組(χ2=5.493，P=0.019，P＜0.05)。與C/T、T/T基因型相比， C/C基因型者患病理性瘢痕的相對風險性(OR)明顯增高(OR=2.041，95%CI:1.116～3.731)。

我們隨機抽取的15例PCR擴增產物測序結果與反向點雜交結果完全吻合，證明了聚合酶鏈反應-反向點雜交結果的正確性。

3討論

外傷、感染、燒傷、外科手術等均可造成病理性瘢痕。一直以來，病理性瘢痕被認為是由于各種原因引起成纖維細胞的異常增殖和膠原纖維大量合成，導致細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）中膠原過度沉積所致[1]。其中，成纖維細胞又被認為是病理性瘢痕形成的關鍵效應細胞，其功能狀態是影響病理性瘢痕發生、發展以及轉歸的主要因素。而目前其產生的深入內因、形成的機制尚未完全清楚[2]，并且在臨床工作中也缺乏有效、可靠的治療方法。

近年來，隨著現代醫學的發展進入到細胞生物學和分子生物學水平，在該領域開展的基礎研究也取得一定進展，并已將成果應用于臨床治療。特別是細胞因子在病理性瘢痕的形成中所起重要調節作用已越來越受到廣泛關注。細胞因子是一種存在于人體中極微量的活性物質，由活化的免疫細胞和某些基質細胞所分泌，介導和調節免疫及炎癥反應的一類小分子多肽，作為細胞外基質間的一種重要的信號傳導介質，它們參與調節成纖維細胞的轉化、增殖、代謝凋亡過程，在創傷修復和瘢痕形成過程中發揮重要調節作用[3]。其中，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1TGFβ1）的作用尤為重要。TGF-β1基因位于第19號染色體長臂上，含7個外顯子和6個內含子，是一種具有多種生物學效應的細胞因子，在胚胎發育和組織損傷的修復和更新中起重要作用，影響傷口愈合過程的所有階段，包括炎癥反應和細胞外基質積累。目前普遍認為TGF-β1與病理性瘢痕形成有密切聯系，這一點已被大量實驗所證實[4-5]。

分子生物學研究表明TGF-β1基因存在著基因變異及基因多態性，這種基因多態性與多種疾病存在密切相關性[6-7]，而與中國漢族人群病理性瘢痕是否相關，目前國內、外鮮見文獻報道。本實驗中，研究對象基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明其基因頻率已達到遺傳平衡并具有群體代表性。研究初步結果提示，TGF-β1基因-509位點C等位基因及CC基因型是中國浙江地區人群對病理性瘢痕的易感因素。可以推測，在組織局部分泌TGF-β1機制中，該位點不同基因型可以通過調節TGFβ1mRNA的轉錄活性的高低，進而影響TGF-β1蛋白表達量的多少。我們的初步研究結果對病理性瘢痕的預測診斷及篩選具有較大潛在的臨床意義，然而更大樣本、更多地域、多民族的印證研究尚有待完善。

本實驗采用的聚合酶鏈反應-反向點雜交方法是由Saiki RK[8]于1989年首次提出，雖然在原理上與正向斑點雜交相似，但卻巧妙地反其道而用之，即反方向的將各種探針固定在基質上，用以檢測受檢的各種標記樣品中與探針互補的核酸物質的變化。近年來應用此法進行β-地中海貧血、囊腫性纖維化等疾病的基因診斷，取得較好效果。該方法分辨率高，技術簡便、快速、可靠，其檢測結果與DNA測序符合率高，值得推廣應用。

[參考文獻]

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[8]Saiki RK，Walsh PS，Levenson CH.Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1989，86:6230-6234.

[收稿日期]2008-03-06 [修回日期]2008-06-16

編輯/張惠娟