中國漢族ＮＯＳ２基因多態性與白癜風發病相關性研究

[摘要]目的：探討NOS2基因－954 G→C位點多態性與白癜風發病的相關性。方法：采用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態性方法，對749例白癜風患者和763例健康人的NOS2基因－954 G→C位點基因型進行分析。結果：白癜風患者NOS2－954 G→C位點基因型的分布與正常對照組相比有顯著性差異，聯合基因型GC+CC及C等位基因在白癜風患者中頻率較高，與臨床資料結合分析表明聯合基因型GC+CC在在發病年齡大于20歲組、活動期患者、皮節型白癜風及伴有自身免疫病和正常對照組之間無顯著差異(P＞0.05)，但在發病年齡小于20歲組、穩定期患者、尋常型白癜風及無自身免疫病組的分布頻率與正常對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結論：NOS2－954 G→C位點基因多態性與白癜風有明顯的相關性。攜帶C等位基因可能會增加對白癜風的易感性。

[關鍵詞]NOS2，基因多態性，白癜風

[中圖分類號]R511.6[文獻標識嗎]A[文章編號]1008-6455（2008）08-1173-03

Study on the association between NOS2 polymorphism and vitiligo

ZHANG Ying，LIU Ling，LI Kai，LI Chun-ying，YANG Li，SUN Lin-chao，GAO Tian-wen

(Institute of Dermatology of Chinese PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032 ，Shaanxi，China)

Abstract：ObjectiveObjective to investigate the association between NOS2－954 G→C polymorphism and vitiligo in Han Chinese people． MethodsNOS2－954 genotypes of 749 vitiligo patients and 763 healthy controls were tested by PCR-RFLP． ResultsWe found a statistical significant association between NOS2－954 C allele and vitiligo (P<0.05).ConclusionNOS2 -954 polymorphism is association with vitiligo．The C allele will increase the susceptibility of vitiligo．

Key words：vitiligo， NOS2， gene polymorpythism

白癜風是一種選擇性毀損黑素細胞的色素脫失性疾病，表現為皮膚局部白斑。目前白癜風的發病機制有多種學說，包括自身免疫學說、神經學說、黑素細胞自身破壞學說、遺傳學說、黑素細胞生長因子缺乏學說等[1-3]。隨著對白癜風研究的不斷深入，大多傾向認為本病是一種多基因遺傳背景下的自身免疫性疾病，是一種多因素疾病。近年來研究發現，遺傳易感性（基因多態性）與白癜風易感性之間存在相關性，白癜風易感基因的研究成為了熱點。NOS2基因編碼人類誘導型一氧化氮合酶（inducible notric oxide synthase），在內毒素或其它細胞因子如TNF、IFN、IL-1、IL-6等誘導下， iNOS活化生成一氧化氮(NO)，一氧化氮是一種細胞間信使，近年來又被看作是一種細胞毒效應分子，可參與自身免疫病的發病，其合成和生物學效應受多種細胞因子調控[4]。一氧化氮可能通過參與黑素細胞破壞和調節自身免疫在白癜風發病中起作用[5]。既往文獻報導NOS2 啟動子區-954G→C突變能增加iNOS活性，促使體內生成大量NO[6-7]。現尚無該位點多態性與白癜風發病的相關報導，本研究中，我們對NOS2-954G→C單核苷酸多態性與中國漢族白癜風發病的關系進行深入研究。

1材料和方法

1.1 研究對象：患者組標本來自2005年6月～2006年6月第四軍醫大學西京醫院皮膚性病科門診，均符合中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組2003年白癜風臨床分型及療效標準[8]。健康對照選取自同一時期在第四軍醫大學西京醫院健康查體者，沒有白癜風家族史，無腫瘤、風濕病及神經系統疾病等。患者組平均年齡(24.7±l3.6)歲，對照組平均年齡(26.4±13.3)歲(P=0.703)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取:抽取白癜風患者及正常對照外周靜脈血(檸檬酸抗凝)5 ml，用DNA提取試劑盒(離心柱型，由北京天為時代科技有限公司提供)按說明書提取基因組DNA，經紫外分光光度儀測定DNA純度，置-80℃保存待用。

1.2.2 NOS2基因型分析：運用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術分析NOS2基因型。

1.2.2.1 引物設計：北京奧科有限公司合成，引物序列參照文獻[6]。序列：PF：5'-CAT ATG TAT GGG AAT ACT GTA TTT CAG-3'， PR：5'-TCT GAA CTA GTC ACT TGA GG-3'。

1.2.2.2 PCR擴增：反應總體系20ul，含基因組DNA約50ng，20pm/L引物各0.5μl。PCR條件：95℃預變性3min，1個循環；95℃變性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共40個循環；72℃延伸7min，1個循環。PCR產物大小573bp。

1.2.2.3酶切：在2μl PCR產物中加入限制性內切酶Bsa I 5U(美國NEB公司)，10×緩沖液1μl，去離子水補至10 μl，50℃酶切5 h，3%瓊脂糖（含溴化乙錠）凝膠電泳分離鑒定酶切產物。

1.3 統計學分析：分別統計病例組和對照組基因型和等位基因的分布頻率。數據經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗后，用SAS 9.0統計軟件分析，采用卡方檢驗，比較白癜風患者組和對照組NOS2基因型分布上的差異，并分析NOS2基因型與白癜風臨床資料的相關性。

2結果

2.1 基因型確定：PCR-RELP產物電泳檢測顯示三種基因型（圖1）：野生型GG（446bp、127bp）、雜合子GC型（573bp、446bp和127bp）、突變CC型（573bp）。

2.2 基因型及等位基因分布頻率：3種基因型在所研究漢族正常對照群體中的分布經Hardy-Weinberg定律吻合度檢測，達到遺傳平衡（P＝0.133），說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一孟德爾群體，證實抽樣和分型結果可靠。如表1所示： GG，GC，CC三種基因型頻率在白癜風患者中分別占83.44%，15.35%和1.2%；在健康對照中分別占87.42%，11.80%和0.79%。GC和CC基因型在白癜風患者中的頻率高于正常對照組(P=0.029)。C等位基因頻率在白癜風患者中高于正常對照組（8.9%vs.6.7%，P=0.028）。

2.3 基因型及等位基因分布頻率與臨床資料關系：如表2所示，患者組聯合基因型Logistic回歸分析提示與野生型基因型GG相比，聯合基因型GC+CC會增加罹患白癜風的危險性，GC+CC調整的比值比（aOR）和95%可信區間（95%CI）：1.352 (1.013-1.805)。GC+CC在不同性別及是否伴隨家族史中無顯著差別（P＞0.05），在發病年齡小于20歲組、穩定期患者、尋常型白癜風及無自身免疫病組的分布頻率與正常對照組有差別（P＜0.05），但在發病年齡大于20歲組、活動期患者、皮節型白癜風及伴有自身免疫病和正常對照組之間沒有顯著差異(P＞0.05)。Logistic回歸分析顯示聯合基因型GC+CC增加了對尋常型和不伴有自身免疫病白癜風的易感性。尋常型GC+CC調整的比值比（aOR）和95%可信區間（95%CI）：1.358 (1.014～1.820)，不伴有自身免疫病GC+CC調整的比值比（aOR）和95%可信區間（95%CI）：1.383 (1.035～1.849)。

3討論

誘導型一氧化氮合酶(iNOS)能催化L-精氨酸生成一氧化氮(NO)，NO具有多種生物學功能，包括神經傳遞、血管擴張、血小板粘附和淋巴細胞粘附的調節，近來又被看作是一種細胞毒效應分子，在組織特異性自身免疫的發病機理中起重要作用[8]。NO作為一種多功能介質，有可能通過破壞黑素細胞、參與自身免疫等環節在白癜風的發病中起作用。既往研究顯示，在脂多糖和細胞因子刺激下，NO可引起正常培養的人黑素細胞自身破壞，導致色素脫失[9]；NO除直接對黑素細胞產生細胞毒性，還可影響黑素細胞與細胞基質的粘連，從而引起白癜風中黑素細胞的破壞[10]。此外，NO參與炎癥與自身免疫介導的組織損傷[11-12]，它可通過影響自身免疫性疾病中TH1/TH2的平衡來調節免疫反應，在高濃度下，能夠直接破壞健康組織，直接參與自身免疫性疾病的發生，還可以通過一些繼發反應，如毒性自由基的產生，誘導促炎癥的細胞因子（腫瘤壞死因子－(TNF-)、IL-1）生成，使血管通透性增加等間接參與自身免疫性損害。NO是否通過自身免疫而在白癜風的發病中起作用，值得我們進一步研究。

人類NOS2基因位于17號染色體q12，其啟動子區域含有多種細胞因子誘導的轉錄因子結合位點，也是細胞因子誘導的啟動子活性所必需的。Kun等[6]報導-954 G→C位點基因多態性與非洲坦桑尼亞和肯尼亞兒童瘧疾患者的嚴重程度相關，認為C等位基因導致NOS2啟動子功能活性增強，產生大量NO，對瘧疾具有殺傷作用。Hobbs等[7]也有類似報導。

本研究發現白癜風患者和正常對照組NOS2-954G→C多態性分布有顯著差異。白癜風患者中C等位基因的頻率高于正常對照組，C等位基因的出現可能會增加白癜風的易感性。進一步分析NOS2-954位點基因型分布與白癜風患者臨床資料相關性表明，GC及CC基因型可能是兒童期發病、尋常型、穩定期、不伴有自身免疫病白癜風患者的易感因素。

本研究首次應用PCR-RELP方法研究發現NOS2-954 G→ C位點基因多態性與白癜風有非常密切的關系，但目前NO及其合酶在白癜風發生發展過程中發揮的作用及其機制尚不完全清楚，NOS2基因多態性與白癜風的可能相關性及作用機制亦有待更深入研究。

[參考文獻]

[1]Ortonne J-PBose SK. Vitiligo: where do we stand[J]? Pigment Cell Res， 1993，6:61-72.

[2]Boissy RE， Nordlund JJ. Biology of vitiligo. In: Arndt KA， LeBoit PE， Robinson JK， Wintroub BU， eds. Cutaneous Medicine and Surgery: An Integrated Program in Dermatology[M]. Philadelphia: WB Saunders Company，1995，1210-1218.

[3]Le Poole C， Boissy RE. Vitiligo. In: Arndt KA， Le Boit PE， Robinson JK， Wintroub BU， eds. Semin Cutan Med Surg[M]. Vol. 16. Philadelphia: WB Saunders Company，1997:3-14.

[4]Vladim'1r Holáˇn， Magdaléna Krulová， Alena Zaj'1cová.Nitric oxide as a regulatory and effector molecule in the immune system[J]. Molecular Immunology2001，38 :989-995.

[5]M.-M. Cals-Grierson， A.D. Ormerod. Nitric oxide function in the skin[J]. Nitric Oxide，2004，10 :179-193.

[6]Kun JF，Mordmuller B，Perkins DJ，et a1．Nitric oxide synthase 2(Lambarene)(G-954C)increased nitric oxide production，and protection against malaria[J]．J Infect Dis，2001；184(3)：330-336．

[7]Hobbs MR，Udhayakumar V，Levesque MC，et a1．A new NOb2 promoter polym orphism aasoc iated with increased nitric oxide production and protection from severe malaria in Tanzanian and Kenyan children[J]．Lancet，2002，360(9344)：1468-1475．

[8]中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組白癜風的臨床分型及療效標準[J].中華皮膚科雜志，2004，37(7):440．

[9]Singh VK，Mehmtra S，Narayan P，et a1.Modulation of autoimmune diseases by nitric oxide[J].Immunol Res，2000，22(1):l-l9.

[10]Roc ha IM，Guillo LA．Lipopolysaccharide and cytokines induce nitric oxide synthase and produce nitric oxide in cultured nolTaal human melgnocytes[J]．Arch Dermatol Res，200l，293(5)：245-248.

[11]Ivanova K， Poole IC， Gerzer R，et a1．Effect 0f nitric oxide on the adhesion of human melanocytes to extracellular matrix components[J]．J Pathol，l997，183(4)：469-476.

[12]Kolb H，Kolb-Bachofen V．Nitric oxide：a pathogenetic factor in auto-immunity[J].Immunol ay，1992，13(5)：157-l60.

[收稿日期]2008-05-25[修回日期]2008-08-15

編輯/張惠娟