空間誘變后的水稻ＳＳＲ標記變異特征研究

摘要；對經過衛星搭載的水稻品種抗倒絲苗種子及后代進行了微衛星標記分析和有關性狀研究。隨機選用151對分布于水稻12條染色體上的微衛星引物對抗倒絲苗及其21個突變株系進行分子標記檢測，結果發現突變株系與原種相比都存在多個標記座位的突變。突變標記座位的多少隨突變系與原種間差異大小而變化。試驗結果表明，空間誘變可使水稻的DNA分子在多個區段發生重復或缺失等結構性變異，從而使水稻的表型及生理指標發生變異。

關鍵詞；水稻；突變體；空間誘變；微衛星標記

中圖分類號；S511；Q754文獻標識碼；A文章編號；0439-8114(2008)07-0733-04

Study on the Characteristics of Rice Induced by Space Radiation with SSR

YUE Xiao-fei1，2，XIE Zhen-wen1，2，WANG Han-ning2，XIE Wen-qing3，CHEN Jun-cong3

(1.College of Life Sciences， Zhongkai University of Agriculture and Technology，Guangzhou 510225，Guangdong，China；

2.College of Agronomy， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，China；

3. Institue of Agricultural Sciences of Taishan City Guangdong Province，Taishan 529220， Guangdong，China)

Abstract； Some traits of the progenies SP3 derived from the rice cultivar “KANGDAOSI MIAO”were investigated using SSR analysis. 151 SSR primer pairs were chosed at random which were distributed throughout 12 rice chromosomes.The results showed that most mutants had more than two different labled loci comopared with origional varity “KANGDAOSIMIAO”.The polymorphism was various among different mutants.The results also showed that the mutation occurred on DNA could be induced by space mutation. Ultimately， the mutation of the DNA will lead to the changes of the phenotype and physiology of the rice varieties.

Key words； rice(Oryza sativa L.)； mutant； space mutation； microsatellite marker

空間誘變是將農作物種子由返回式衛星帶上高空，在空間各種環境條件作用下，引起后代產生形態、生理生化、產量、育性等特征特性的遺傳變異。回收種子經地面觀察、選擇突變體，以便獲得優良的新品種及特異新種質，從而開拓出作物遺傳育種的新領域[1]。眾多的空間誘變試驗表明，空間誘變具有變異頻率高、變異幅度大、易獲得理想的突變體，甚至可以獲得一些罕見突變體[1～6]。經典的選育方法常常利用形態特征來區分各種突變體，雖為品種改良做出了重大貢獻，但不能從本質上闡明突變的機理。隨著分子標記技術的發展，各種標記已被應用于突變體的研究[7，8]。

近年來，水稻航天育種機理研究已從表型變異篩選和利用研究[2-5]逐漸向空間誘變后基因組變異特征、突變性狀的遺傳特性等研究發展，但是水稻航天誘變的分子機制仍然需要進行深入研究。本研究以水稻航天誘變后的突變株系為研究對象，利用微衛星標記對空間輻射誘變的水稻突變體后代進行了DNA層面上的分析研究，初步分析了性狀變異的機理，探索了水稻航天誘變后性狀變異與基因變異的關系，旨在為研究水稻航天誘變的分子機理提供參考。

1材料與方法

1.1材料

研究材料為水稻品種抗倒絲苗(由廣東省臺山市農業科學研究所選育提供)及其航天誘變株系， 其中以抗倒絲苗為對照。抗倒絲苗是臺山市農科所于2002年用早稻八桂香與豐合占雜交育成的早晚型優質新品種。全生育期早稻125～130 d，晚稻110～115 d。該品種分蘗力強，成穗率高。整個生育期莖稈粗壯，株型稍緊，株高較矮，耐肥抗倒伏。葉片硬、直、厚，葉色青翠，全生育期轉色順調，后期熟色好，成熟時青枝臘稈，株高94～97 cm，穗大，著粒密，平均粒長20.9 cm，平均每穗總粒142.1粒，實粒121.4粒，結實率85.4%，千粒重16～17g，粒型絲苗型，米粒晶瑩透亮，堊白少，油色好，軟硬適中，有飯味、口感良好。2005年早稻小區試種，表現豐產性能好。平均產量為4 145.5 kg·hm-2，與對照齊粒絲苗產量相當。該品種適合各類肥力田種植，最好在肥力較高的田塊種植，高肥力能充分發揮該品種的高產優勢。在栽培上該品種可粗放粗養，耐肥抗倒，增施穗肥和粒肥能有較提高產量。

1.2處理方法

本研究組于2005年選送了水稻種子、參加中國農科院航天育種中心牽頭組織的植物航天空間誘變育種試驗；經空間搭載的抗倒絲苗當代種子和留地對照種子于2006年春種植于廣東省農科院大豐基地試驗田，SP1群體為1 200株，正常水肥管理；成熟時隨機單株留種100株。SP2代于2006年晚季在廣東省臺山市農業科學研究所試驗田種植，同期種植對照品種，正常水肥管理；每個SP2株系種20株；從每個SP2株系按盡可能保留株系內變異的原則選留3株，共選留300株SP3代；2007年早季在臺山市農科所試驗田種植SP3代，每個SP3株系種植10株，正常水肥管理；結合SP2、SP3表型觀察，從SP3中篩選出21個粒型、株高、植株顏色、生育期等[9]有明顯變異的突變株系用作微衛星分析。

1.3SSR分析

水稻總的DNA提取按CTAB[10]法進行。研究中使用的微衛星引物依據網上(www.gramene.org)提供的序列交由上海生工合成。按均勻覆蓋水稻12條染色體的原則選取151對SSR引物。所用的反應體系為25 μL的反應體系[11]；0.2 μmol·L-1的引物，

0.2 mmol·L-1的dNTP，10×PCRbuffer(50 mmol·L-1 KCl，10 mmol·L-1 Tris-HCl pH8.3，1.5 mmol·L-1 MgCl2，0.01%明膠)，50～100 ng的模板DNA，1個單位的Tag酶。反應程序為[11]；94℃預變性7 min，35次循環(94℃ 45 s，55～55.5℃ 45 s，72℃ 1 min)擴增產物利用6%的聚丙烯酰凝膠進行電泳，然后通過銀染法進行分析。

2結果與分析

2.1用SSR分析多態性

選用了151對分布于水稻12條染色體上的微衛星標記，其中有多態性的引物30對。30對引物在22個材料(包括對照)上共檢測到76個等位基因，平均每對引物檢測2.5個等位基因(圖1～4)。

試驗中發現，SSR引物檢測出等位標記座位的效率有較大差異，RM447和RM520(圖2、圖3)檢測出多個等位基因的差異，另一些SSR引物只檢測出個別材料的特異等位標記座位，如RM569、RM488(圖1、圖4)。通過試驗還發現不同的突變株系的變異幅度也是不一樣的，有的變異標記座位多，如8、15、10、20等突變株系，有些則變異標記座位少

(表1)，如14、17等突變株系，而有些株系則未檢測到突變標記座位，如2、3、4等株系。

與原種對照比較，SSR多態性的表現形式有多種；A——擴增片斷數增多；B——擴增片斷數減少；C——分子量增大；D——分子量減小；本試驗檢測到的多態性中，出現的類型為C、D、AC、AD 4種類型。其中C型與D型占變異類型的大部分，而未出現B型擴增，在對照材料上擴增出來的條帶全部為1條帶，說明對照材料在各個擴增標記座位上是純合的(未經過輻射誘變)，這一點與楊存義等[12]對水稻品種秋光后代的微衛星結果的分析不同。

2.2不同突變株系的表型及生理指標分析

通過對表1的統計結果分析本試驗選取了變異位點較多的株系(10、15、19、20、23)與對照(CK)進行表型(株高，分蘗數質量-數量性狀[13])及生理指標的差異顯著性比較(表2)，而且通過對變異株系與對照的表型觀察發現，突變株系與對照的植株顏色、葉片寬度、粒型方面都有較大的差異，突變株系比對照的葉片顏色較淺、葉片變寬、粒型較對照變長。初步說明DNA分子內部發生的變異是導致植株外部表型變化差異的直接原因(因為微衛星標記在編碼區和非編碼區的分布沒有明顯的差別)。而且通過試驗觀察可以看出，發生變異的位點多的植株在外部形態上的表現與對照相比，差異的確顯著(如本試驗中的株高、分蘗數、植株顏色、粒型及葉片寬度)。

3討論

空間誘變育種是近年來隨航空航天技術的發展而興起的一種育種手段。許多研究結果顯示，空間的高真空、微重力和高能輻射等特殊條件對生物的誘變頻率高、變異譜寬、易獲得理想的突變體，甚至可獲得一些罕見的突變體[1-5]。空間誘變的后代群體中為什么會出現一些罕見的突變體，空間誘變與一般理化誘變機理有何不同，人們一直在關注這些問題，我國科學家開展空間誘變育種工作主要是在田間對變異植株進行農藝性狀的選擇，雖獲得了不少育種材料，但對其誘變機理的研究較少。由于分子標記技術具有數量多、基因組內分布均勻、檢測容易、穩定性高等特點[14]，而其中的微衛星標記具有穩定、操作簡單、快速的特點[15]，且微衛星廣泛存在于生物基因組中，水稻基因組約80 kb出現1個微衛星，水稻基因組中約有5 700～10 000個微衛星[16]。研究表明微衛星在編碼區和非編碼區分布的頻率沒有顯著差異[15]。正是基于以上認識，本試驗選用微衛星標記分析突變株系之間的突變特點。

本研究發現，與對照相比，突變系在多個標記座位發生變異，不同的突變株系發生的突變標記座位不一樣，且不同突變系的突變標記座位數目多少也存在很大的差異，有些甚至沒有檢測到突變標記座位。微衛星標記多態性是由于串連重復序列重復次數的不同而造成的，因此可認為空間條件的輻射誘變可使水稻染色體上的DNA在多個區段內發生重復或缺失等結構性變異，這與楊存義等[12]人利用微衛星對水稻品種秋光后代突變株系的研究結果相同。研究中還發現在突變株系當中突變標記座位的多少與由主基因、微效基因共同控制的質量-數量性狀(株高、分蘗數的差異顯著性比較以及對植株顏色、葉片寬度、粒型等性狀的觀察比較)有較大的關系，如本試驗中選取了突變標記座位較多的突變株系與對照進行性狀差異顯著性比較，結果差異顯著。研究結果初步揭示了水稻航天誘變過程中性狀變異的可能機制；水稻種子航天誘變后引起了基因組的變異，從而引起水稻的表型差異；表明分子標記對揭示空間誘變機理研究是有效的手段之一。

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