小白菜花藥培養胚誘導和植株再生

摘要：以10個小白菜雜交種為試材，采用花藥培養方法，研究胚狀體發生及其再生植株的誘導方法。結果表明，不同基因型的小孢子胚狀體發生頻率有明顯差異，有10個基因型誘導得到胚狀體，最高的出胚率達到18.31%；適宜濃度的活性炭可以促進胚狀體的誘導，培養基中添加谷胺酰氨可以提高胚狀體的誘導率；1.0%的瓊脂濃度為胚狀體繼代培養最適宜的濃度，MS+1.0%瓊脂為小白菜小孢子植株再生最適宜的培養基。不同透性的封口膜對小白菜生根有很大的影響。

關鍵詞：小白菜；花藥培養；胚狀體；植株再生

中圖分類號：S634.3；Q943.1文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0737-03

Anther Culture and Plantlet Formation in Chinese Cabbage

LIU Ru-e，FENG Hui，WANG Chao-nan，LI Dan，ZHOU Ying

(College of Horticulture， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China)

Abstrat： Major factors that influence the formation of embryoid and plantlet formation in Chinese cabbage during anther culture were been probed to improve the culture system and create excellent DH populations. The effects of genotypes， activated carbon， L-Glutamine and L-Serine， on embryoid induction were studied in ten F1 hybrids of Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis) by anther culture method. It was found that the rate of embryogenesis was related to the donor plants. Ten varieties were induced to form embryoids and the highest yield was 18.31%，L-Glutamine and activated carbon could remarkably promote the formation of embryoid. MS added with 1.0% agar was the suitable culture medium.

Key words：chinese cabbage；anther culture；embryoid；plantlet

小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis L.)又稱白菜、青菜，是我國普遍栽培的一種蔬菜作物，屬于十字花科，蕓薹屬，蕓薹種，白菜亞種。異花傳粉，雜種優勢十分顯著。近幾年來隨著單倍體育種在蕓苔屬農作物上的普遍應用，充分證明單倍體育種與常規多代自交獲得純系相比，具有周期短、效率高、純系穩定等特點。目前國內外學者已經將該項技術應用于大白菜、小白菜、菜薹、芥菜、小白菜、羽衣甘藍[1-4]等蕓薹屬作物上，并已取得了很大的進展。但是，迄今未建立起小白菜花藥培養誘導和再生及利用的完善體系，為此，本試驗以引自日本、韓國和本地且在國內大面積推廣的10個優質小白菜雜交種為試材，對影響花藥培養胚狀體發生和植株再生的主要因素進行了系統的研究，并將其試配組合加以應用，旨在完善培養體系，縮短小白菜的育種進程。

1材料與方法

1.1材料

供試材料見表1。試驗于2005年12月～2007年11月在本院蔬菜基地進行，12月初將種子催芽后于0～4℃的條件下低溫春化處理16 d，12月中旬播種于穴盤。1月初幼苗長至5片真葉后，定植于花盆。正常水肥管理，盛花期進行花藥培養。

1.2方法

開花期上午8∶00～10∶00，取3～5株主花序或側枝花序上長度為2～3 cm、小孢子發育處于單核靠邊期的花蕾，先用流水沖洗30 min，再用75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl2溶液消毒5 min，無菌水沖洗3次，每次5 min。用滅過菌的鑷子剝開花蕾取出花藥，去除花絲，接種到已配制好的固體培養基上，用Parafilm封口。首先在33℃高溫、黑暗條件下處理48 h，再轉入25℃恒溫培養箱中暗培養，直至出胚。

以改良B₅和大量元素減半的改良B₅為基本培養基，研究不同基因型在產胚上的差異。首先對花蕾進行2℃低溫預處理12 h，花藥接種后轉入33℃下進行高溫處理48 h；添加活性炭的濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.4 g·L^-1，谷氨酰胺濃度設0.1、0.2、0.3 g·L^-1 3個濃度，絲氨酸濃度設0、0.2、0.3 g·L^-1等3個梯度，以研究適宜的誘導濃度。

以獲得的胚狀體為材料，對小白菜花藥培養植株再生影響因素進行研究，研究不同瓊脂含量(分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4%)、不同培養基(B₅、MS、1/2MS)對成苗的影響。每份試材選擇80個花蕾挑取花藥，培養6皿，設置3次重復。

2結果與分析

2.1基因型及培養基對小孢子胚發生的影響

由表1可以看出，花藥接種在不同培養基上經熱激處理后，花藥明顯膨大，培養3周左右后，在供試的10個基因型中，大量元素減半的改良B₅培養基有9個獲得了胚狀體，從產胚量上可以看出，不同基因型之間存在顯著的差異(表1，圖1)。其中菜園的出胚率最高，達到了18.31%，而TAIKO未誘導出胚。在改良B₅培養基上也有9個基因型誘導出了胚，但大量元素減半的改良B₅培養基出胚的情況方面，在不同基因型之間均高于改良B₅培養基。

2.2不同濃度的活性炭對小孢子胚誘導的影響

以菜園和金夏蒔為試材，分別接種在不同活性炭濃度的大量元素減半的改良B₅基本培養基上，研究小白菜花藥培養最適宜的活性炭濃度，結果見表2。由表2可以看出，不同濃度的活性炭對小白菜胚狀體誘導率的影響存在顯著的差異，其中添加0.8 g·L^-1的活性炭對小白菜花藥培養誘導效果最好，其次為0.4 g·L^-1，這說明活性炭濃度過高過低均不利于小孢子的萌發。

2.3不同濃度谷氨酰胺和絲氨酸對小孢子胚誘導的影響

以菜園為試材，取盛花期的花蕾，挑選出處于單核靠邊期的花蕾，用紗布裹好，放于2℃的冰箱中進行低溫處理，然后按花藥培養的方法接種在添加不同濃度的谷氨酰胺和絲氨酸的改良B₅加倍的固體培養基上培養，用Parafilm封口后，在33℃高溫、黑暗條件下培養。研究不同濃度的谷氨酰胺和絲氨酸對胚狀體發生的影響，結果列于表3。從表3可以看出，培養基中加入谷氨酰胺后，可明顯提高出胚率，其中以0.3 g·L^-1效果最佳。在培養基中加入絲氨酸后出胚率有所下降，說明絲氨酸對小白菜花藥培養的胚狀體發生有抑制作用。

2.4胚狀體培養和植株再生

2.4.1不同瓊脂含量對小白菜花培植株的影響以菜園的胚狀體為試材，篩選小白菜繼代培養的最適宜培養基的瓊脂含量，結果見于表4。由表中可以看出，瓊脂含量為1.0%的成苗培養基大部分的子葉型胚狀體成活率最高，達到了69%，胚狀體發育正常，3～4 d子葉開始變綠，胚根逐漸伸長并長出根毛，2周后子葉型的胚狀體長成小植株(圖2)，而極少數的魚雷型的胚狀體有兩條成苗途徑，其一，子葉萌發，與子葉型胚狀體成苗相似；其二，經脫分化后形成綠白致密的愈傷組織，再分化成幼苗。

2.4.2基本培養基對胚狀體成苗的影響將部分子葉型胚分別轉入B₅、MS、1/2MS的基本培養基上，瓊脂含量為1.0%，蔗糖為3.0%，在光照培養室中培養，3周后統計成苗率，結果見表5。表5顯示，轉入MS培養基的胚狀體成苗率是轉入B₅培養基的4倍，轉入1/2MS培養基上的胚狀體成苗率介于兩者之間，轉入B₅培養基中的胚狀體雖然胚根伸長，但是胚芽不生長而發生組織褐化，轉入1/2MS培養基胚芽愈傷組織發育有的褐化，逐步分化，這說明MS是小白菜最適宜的成苗培養基。幼苗經逐次壯苗后轉移到MS+0.1 mg·L^-1 NAA的生根培養基上，2周左右長出4～8根白色粗壯的直根系(圖3)，經煉苗后，將生根苗移栽入含基質的經消毒的營養缽中，再次煉苗后放入溫室中即可以獲得小白菜DH系(圖4)。然后進行正常的水肥管理和補光措施，即可通過春化作用獲得大批的純合DH種子。

3小結與討論

通過花藥培養能夠獲得純合DH系。將其應用于雜交種親本純化，可以縮短育種年限，加快育種進程，因此越來越受到育種工作者所采用。試驗結果表明，不同基因型的花藥培養胚狀體發生頻率有明顯差異，在10個品種中有9個誘導得到了胚狀體，最高出胚率達18.31%。可見，基因型是影響小白菜花藥培養成功與否的關鍵因素。這與前人的研究結果一致[5]。

本試驗也證明大量元素減半的改良B₅培養基能夠提高胚狀體的誘導，這與王超楠[6]在小白菜小孢子培養上的研究結果一致。活性炭過高過低均不利于胚狀體的萌發，因為活性炭在吸附有害物質的同時，也吸收一些必要元素，使培養基中的有效成分大大降低，姜鳳英[7]在羽衣甘藍上也有類似的報道。培養基中添加一定濃度的谷氨酰胺可以促進胚狀體的萌發，這與馮輝[8]等在小菘菜上的研究結果一致。

MS培養基中，瓊脂濃度為1.0%時有利于胚狀體發育成苗。MS+0.10 mg·L^-1 NAA為小白菜最適宜的生根培養基。同時表明，透氣膜對小白菜生根作用明顯。試驗證明，只要溫度、濕度、光照適宜，小白菜花藥培養小孢子植株的成活率可以達到98%。

影響胚狀體誘導率的因素很多，本試驗研究了基因型，培養基成分、不同添加物濃度等因素對小孢子胚發生的影響。還有很多因素如培養基的pH值、采蕾期的溫度和小孢子發育時期等因素都影響著胚狀體的發生和發育，還需做進一步研究。本試驗基本建立起了小白菜的花藥培養的培養體系，為今后的單倍體育種實踐工作奠定了基礎。

參考文獻：

[1]李俊明. 植物組織培養教程[M]. 北京： 北京農業大學出版社，1992.

[2]SATO T，NOSHIO T，HIRAI M. Varietal differences in embryogenic ability in anther culture of chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensi)[J]. Japan J Breed，1989，39： 149-157.

[3]LICHTER R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J].E Pflanzenphysiol，1982，(105)：427-434.

[4]張綠紅，陳紅. 園藝植物花藥培養研究進展[J]. 安徽農業科學，2007，35(17)：5140-5142.

[5]蔣武生，耿建峰，張曉偉，等. 基因型和有機附加物對小白菜花藥培養胚狀體誘導的影響[J]. 中國瓜菜，2006(2)：1-4.

[6]王超楠，馮輝，姜鳳英，等.小白菜小孢子胚狀體誘導影響因素的研究[J]. 華北農學報，2007，22(增刊)：204-206.

[7]姜鳳英，馮輝，王超楠. 羽衣甘藍的小孢子培養和植株再生[J]. 植物生理學通訊，2005，41(6)：725-727.

馮輝，劉如娥，王超楠，等. 小菘菜花藥培養技術的研究[J]. 園藝學報，2007，34(5)：1194.