鄂西地區青蒿遺傳多樣性研究

摘要：利用RAPD和ISSR分子標記技術對11份鄂西野生青蒿種質進行了遺傳多樣性研究。結果表明，篩選出的8條RAPD和8條ISSR引物分別產生86條和102條擴增帶，其中多態性條帶分別為53條和62條，分別占總數的61.63%和60.78%。用POPGENE對兩種標記方法的遺傳多樣性進行計算，有效等位基因數分別為1.355 2和1.370 7，基因多樣性為0.211 0和0.214 3，Shannon信息指數為0.318 8和0.321 6。以Nei氏遺傳距離矩陣按UPGMA方法聚類分析RAPD和ISSR標記的遺傳距離分別為0.035 5～

0.411 3和0.142 3～0.401 1，平均值各為0.228 8和0.233 8，表明青蒿種質具有比較豐富的遺傳變異，同時也說明，盡管Mantel相關性檢測兩種標記方法相關性較低(r=0.543 9，P<0.005)，但都可以有效地揭示青蒿種質的遺傳多樣性狀況。

關鍵詞：青蒿；遺傳多樣性；RAPD分子標記；ISSR分子標記

中圖分類號：S567.21+9；Q503文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0740-04

Study on Genetic Diversity of Artemisiae annie Varieties in the Westen Hubei

SHI Kai-ming1ab，2，AI Xun-ru1a，Ding Li1a，ZHOU Yi-feng1ab，2

(1a. Biological Science and Technical Department； 1b. Key Laboratory for Protection and Utilization of Biological Resources of Hubei Province，1. Hubei Institute for Nationalities， Enshi 445000， Hubei，China； 2. Key Laboratory for Biological Technology of Chinese Traditional Medicine of Hubei Province， Hubei University， Wuhan 430062，Hubei，China)

Abstract：The genetic diversity of 11 Artemisiae annie types in the Westen Hubei have been investigated with the techniques of RAPD and ISSR. The results showed that 86 and 102 bands were obtained by RAPD and ISSR markers amplified through 8 selected primers respectively. 53 bands and 62 bands were polymorphic， which accounted for 61.63% and 60.78% respectively. Through POPGENE analysis，effective number of alleles per locus， gene diversity and Shannon’s information index were 1.355 2，0.211 0 and 0.318 8 by RAPD， and were 1.370 7， 0.214 3 and 0.321 6 by ISSR respectively. The UPGMA clustering indicated that the genetic distance was 0.035 5～0.411 3 by RAPD and 0.142 3～0.401 1 by ISSR， of which the average value was 0.228 8 and 0.233 8 respectively. The above results showed that there was a relatively rich genetic variation in the varieties tested and that both techniques wereeffective in revealing genetic diversity in Artemisiae annie although they had a low correlation(r=0.543 9， P<0.05=.

Key words：Artemisiae annie；genetic diversity；RAPD molecular marker；ISSR molecular marker

黃花蒿(Artemisia annua L. Artemisiae Annie)是菊科一年生草本植物，又名青蒿，別名蒿子、臭蒿、香蒿、苦蒿、臭青蒿、香青蒿、細葉蒿、細青蒿、草青蒿、草蒿子。生長于山坡、林緣及荒地，廣布于我國各地；亞洲其他地區、歐洲東部及北美洲也有生長[1]。是我國傳統的中藥，民間用作消暑、退熱、感冒等的治療，黃花蒿還具有抗瘧、抗血吸蟲、抗病毒與增強機體免疫等作用[2]。黃花蒿含有的青蒿素是一種新型抗瘧藥，主要用于間日瘧、惡性瘧的癥狀控制以及耐氯喹蟲株的治療，也可用于治療兇險型惡性瘧，如腦型、黃疸型瘧疾等[2]。本研究以素有“華中藥庫”之稱的鄂西地區所收集的12個野生黃花蒿種質資源為研究對象，采用RAPD分子標記檢測手段，從分子水平探討其遺傳多樣性狀況，揭示分析群體遺傳變異，初步構建鄂西地區黃花蒿的核心種質資源庫，為有效利用分子標記評價黃花蒿種質資源遺傳多樣性及遺傳基礎提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1青蒿種質試驗以鄂西地區所收集的11個野生黃花蒿種質資源為研究對象，采集當年萌發的新葉作為提取基因組DNA的材料，各品種的名稱、來源及特性見表1。

1.1.2主要儀器及試劑日立高速冷凍離心機，G-box凝膠成像分析儀，ABI PCR擴增儀，JY-5000電泳儀(北京六一儀器廠)等；Taq polymerase、dNTPs、λDNA(皆為大連寶生物工程公司出品)等購自武漢華順生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取純化參考改良的CTAB法[3]對黃花蒿新葉基因組DNA進行提取和純化。

1.2.2RAPD擴增、檢測25 μL反應體系，擴增程序為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃鏈延伸2 min，循環35次后72℃延伸10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色15 min后于凝膠成像分析儀上觀察、記錄RAPD擴增譜帶，并保存于計算機中。

1.2.3ISSR擴增、檢測ISSR反應體系采用了鄧婧等建立的反應體系[3]。檢測方法同上。

1.3試驗數據統計及遺傳分析

用篩選出的引物對11份青蒿種質進行擴增，按凝膠同一位置上DNA條帶的有無進行統計，有帶的記為1，無帶的記為0。以此形成ISSR表型數據矩陣，采用多樣性分析的POPGENE32軟件[4]分別對RAPD和ISSR擴增結果進行遺傳分析，得到多態性位點及其百分數(PPB)、有效等位基因數(Ne)、基因的多樣性(H)及Shannon信息指數(I)等遺傳參數。計算Nei氏遺傳距離，并按UPGMA方法聚類，繪制聚類圖。

2結果與分析

2.1引物篩選

分別對100個RAPD隨機引物和38條ISSR引物進行初選，大多數引物能擴增出多態性條帶，數目從1～15條不等，分別進行復選，從中各選出8個清晰、穩定并能擴增出多態性位點的RAPD和ISSR引物，對這11份材料進行擴增，用以遺傳分析，引物序列見表2。

2.2多態性

兩種標記對參試的11份青蒿種質進行擴增，檢測出的位點及多態性情況見表3。由表3可知，8個RAPD引物共檢測出位點86個，平均每個引物10.75個，其中多態性位點53個，占61.63%。平均每個引物多態性位點6.625個；8個ISSR引物共檢測出位點102個，平均每個引物12.75個，其中多態性位點62個，占60.78%。平均每個引物多態性位點7.75個。盡管兩方法得到的多態位點百分率相近，但ISSR標記檢測出的位點數和多態位點數更多些，每個引物平均多檢測出2個位點。

2.3遺傳多樣性及遺傳相似性

有效等位基因數和基因多樣性是衡量遺傳變異最常用的兩個遺傳指標，具有明確的遺傳學意義。Shannon信息指數本身沒有遺傳學意義，但方便與同類研究進行比較[4]。利用POPGENE32軟件計算了分析樣品兩種標記方法的3個遺傳參數，結果見表3。表3顯示，RAPD方法的有效等位基因數為1.311 2，基因的多樣性為0.201 1，Shannon信息指數為0.314 5；ISSR方法的3個參數分別為1.320 3， 0.212 3和0.320 2。總體上看，ISSR標記所獲得的數據值都略高于RAPD標記，也就是說ISSR標記獲得單位引物多態位點的能力高于RAPD。計算結果表明，供試的鄂西青蒿種質具有比較豐富的遺傳變異。從基于RAPD和ISSR標記的樹狀聚類圖(圖1)可以看出，11份供試材料間具有一定程度的遺傳變異，其品種間的遺傳距離分別為0.035 5～0.411 3和0.142 3～0.401 1，平均值分別為0.228 8和0.233 8。雖然兩種標記方法的聚類結果不完全相同，但總體趨勢是一致的。從RAPD聚類圖上可以將11份種質分為3組，其中1號和2號材料可劃為一組，10號和11號材料一組，3、4、5、6、7、8、9號材料可為一組；從ISSR聚類圖上可以將11份種質分為4組，其中1號和2號材料可劃為一組，10號和11號材料一組，3、4、5、6號材料一組，7、8、9號材料一組。兩種聚類結果基本反映出了種質變異的地域性。在RAPD標記的聚類圖中，盡管6、7號樣親本不同，卻先聚到了一起，而8、9號樣親本相同卻后聚到一起，這與所采用的標記方法有關，即RAPD方法及其所用的引物和引物數量有關。在使用的隨機引物及其數量有限的情況下，與實際劃分產生一些出入是正常的，這也是為什么采用RAPD分子標記技術進行遺傳分析時要盡可能地保持試驗條件的穩定性和一致性、要盡量采用更多的引物進行分析的原因所在。

2.4兩種方法的相關性分析

對RAPD和ISSR標記的相似系數矩陣利用Mantel檢驗進行相關性檢測，發現兩種結果存在較低的相關性(r=0.512 7，P<0.05)。

3小結與討論

自1990年Willians[5]創建隨機擴增多態DNA(RAPD)分子標記技術以來，由于該技術具有不要求預知基因組序列信息、操作簡單、成本較低等優點，而在遺傳多樣性等研究領域得到了廣泛應用，ISSR標記技術由Ziekiewicz[6]于1994年最早提出，并應用于遺傳多樣性研究，其不僅有以上RAPD的特點，還具有擴增產物的特異性更強、穩定性更高的優點[7]，因此近年來這一技術的應用速度非常快。

本項研究同時采用RAPD和ISSR兩種分子標記技術，對鄂西的11份青蒿種質進行了遺傳多樣性分析。從研究結果來看，兩種標記皆可作為青蒿種質遺傳多樣性分析的手段。兩方法得到的多態位點百分率相近，RAPD檢測到的多態位點百分率為61.63%，ISSR為60.78%；但ISSR標記檢測出的位點數和多態位點數更多些，分別為102和62條，比RAPD標記的86和53條多出了16條和9條，也就是說ISSR標記可以揭示更為豐富的遺傳信息。本研究未得到其他文獻報道的ISSR揭示的多態性高于RAPD的結果[8-10]，這可能與采用的引物有關，因為試驗篩選引物時更偏重于指紋圖譜的建立和品種的鑒別，而沒有把多態性置于首要考慮的因素。

遺傳多樣性計算結果表明，有效等位基因數、基因多樣性、Shannon信息指數3個遺傳參數值分別是RAPD法為1.355 2、0.211 0、0.318 8；ISSR法為1.370 7、0.214 3和0.321 6。總體上看ISSR標記所獲得的值都略高于RAPD標記，也就是說ISSR標記獲得的單位引物多態性位點的能力高于RAPD。計算結果表明供試的鄂西青蒿種質具有比較豐富的遺傳變異，這主要是由于青蒿在鄂西境內分布廣泛、在不同生態地域都有分布、遺傳基礎較為豐富所造成的。UPMGA聚類分析的結果也顯示了11份青蒿種質間具有一定的遺傳變異，兩種標記的聚類分組趨勢基本相同。綜上所述，盡管RAPD和ISSR的相關系數較低(這與兩種標記技術對基因組不同特性片段的擴增有關[7])，但兩者反映的青蒿種質的遺傳多樣性狀況和聚類結果相似，都可用于進行青蒿資源的遺傳多樣性分析，鑒于ISSR標記技術的相對穩定性，檢測出的遺傳信息更為豐富，建議采用ISSR方法更好一些。

參考文獻：

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