茉莉花種質(zhì)資源遺傳多樣性的ＩＳＳＲ分析

摘要：利用ISSR技術(shù)對茉莉花30份材料的遺傳多態(tài)性進行了分析。從100個隨機引物中篩選出10個多態(tài)性引物，共擴增出70條DNA條帶，其中34條為多態(tài)性條帶，占48.57%，平均每個引物擴增出3.4條DNA帶。按照相同遷移位上有擴增帶記為1、無帶為0的方法構(gòu)建ISSR表型數(shù)據(jù)的矩陣，用NTSYSpc 2.0軟件對茉莉花30個材料進行UPGMA聚類分析，計算出30份材料的遺傳相似系數(shù)為0.86～0.98，平均相似系數(shù)為0.91，并在此基礎(chǔ)上建立了聚類分析樹狀圖，在相似系數(shù)0.86處，將30份材料劃分為A、B 2大聚類組。

關(guān)鍵詞：茉莉花；品種；ISSR；遺傳多樣性

中圖分類號：S685.16；S602.4；Q503文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0744-03

ISSR Analysis on Genetic Diversity of Jasminum sambac

QIU Chang-yu1，2，GAO Guo-qing1，CHEN Bo-lun1，ZHOU Rui-yang2，ZHANG Jia-qiang2

(1. Key Laboratory for Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China；

2. College of Agrononry for Guangxi University， Nanning 530004，China)

Abstract： ISSR assessment of genetic variations in 30 varieties of Jasminum sambac was carried out. Ten primers were screened from 100 arbitrary primers， and a total of 70 DNA bands were amplified， among which 34(48.57%)were polymorphic. The average number of DNA bands amplified by each primer was 3.4， and the average genetic distance among 30 varieties was 0.91. Based on UPGMA cluster analysis of 70 DNA bands amplified by 10 primers，a DNA molecular dendrogram was established， which divided the 30 varieties into two groups： group A and B.

Key words： Jasminum sambac； variety； Inter-simple sequence repeats； genetic diversity

茉莉花[Jasminum sambac(Linn.)Aiton.]為木樨科素馨屬(或茉莉?qū)?多年生灌木，屬亞熱帶植物，原產(chǎn)于波斯灣一帶。其鮮花香氣清幽，花性味辛、甘、涼，具有理氣、開郁、辟穢、和中的作用，已廣泛用于化妝品、保健食品領(lǐng)域。我國是世界上茉莉花產(chǎn)量最多的國家[1]，但生產(chǎn)上品種繁多，同物異名、異物同名現(xiàn)象十分突出，缺乏明確的分類指導(dǎo)；為了理順各品種間的親緣關(guān)系，有必要對其遺傳多樣性進行研究。ISSR標記是20世紀90年代中期發(fā)展起來的一種新型的分子標記技術(shù)[2]，與RFLP和RAPD相比，具有較高的多態(tài)性，Nagoka等[3]在小麥的ISSR標記研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR標記可獲得幾倍于RAPD標記的信息量。由于其結(jié)合了SSR和RAPD的優(yōu)點，因而具有模板需要量少、多態(tài)性豐富、無需試劑盒、結(jié)果記錄方便、試驗成本低、操作簡單、穩(wěn)定性較高等優(yōu)點，現(xiàn)已成功地用于許多栽培種和野生種的遺傳多樣性研究。應(yīng)用ISSR技術(shù)進行茉莉花品種的遺傳多樣性分析，國內(nèi)外迄今還未見報道，基于茉莉花表型分類系統(tǒng)的混亂，也十分有必要采用分子標記技術(shù)對茉莉花的各類(居)群的分類地位、親緣關(guān)系及演化規(guī)律進行精確的研究[4]。筆者初步探索應(yīng)用ISSR技術(shù)，分析了茉莉花基因組DNA遺傳多樣性的可行性。

1材料與方法

1.1試驗時間和地點

于2005年9月15日到廣西橫縣產(chǎn)地采樣，采樣后開始室內(nèi)的工作，整個試驗在廣西農(nóng)業(yè)科學院重點實驗室完成。

1.2材料

1.2.1植物材料供試材料為廣西橫縣當?shù)鼗蛞M的品種，取茉莉花的幼葉，用裝了冰的冰盒帶回實驗室，于-20℃低溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2生化試劑Taq酶、dNTPs購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購自北京華美公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.3儀器設(shè)備PCR儀為德國Biometra公司生產(chǎn)的GeneAmp OR PCR System 9700，離心機為德國Sigma公司產(chǎn)品，純水器為美國Pull公司產(chǎn)品，紫外分光光度計為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，紫外凝膠成像系統(tǒng)UVP是Pharmacia公司產(chǎn)品，水浴鍋、電泳槽等儀器為國內(nèi)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。

1.2.4ISSR引物所用隨機引物為17～18個堿基的寡聚核苷酸，由上海鼎安生物科技公司合成。

1.3方法

1.3.1茉莉花基因組DNA的提取采用改良后的CTAB法提取，取茉莉花幼葉0.2 g左右，加液氮快速研磨至粉狀，將樣品轉(zhuǎn)入2 mL的離心管，加入0.9 mL的2%CTAB溶液和20 μL的巰基乙醇，搖勻，65℃水浴60～90 min。加入氯仿︰異戊醇(24︰1)0.9 mL，搖勻，12×1 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)2次，吸取上清液，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，置-20℃、1～2 h，取出，9×1 000 r·min-1離心5 min。棄去溶液，留下絮狀沉淀，加入200～300 μL的70%乙醇清洗，再離心，干燥后將沉淀用200 μL含RNA 酶的TE溶液，在37℃水浴鍋溫浴90 min，取出后用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)在常溫下離心5 min，吸取上清液，1/10體積的3 mol·L^-1 NaAc，二倍體積的無水乙醇，輕輕搖勻，置-20℃冰箱1 h左右，離心后再用70%的酒精清洗，干燥，加TE保存(4℃保存?zhèn)溆茫L期保存于-20℃環(huán)境)。

1.3.2DNA總量的檢測稱取0.2 g的瓊脂糖，加入20 mL 1×TBE制成膠，將2 μL左右的6×loading Buffer指示劑和5 μL DNA樣品混勻后，4～5 V·cm-1電泳，30～40 min后觀察與拍照。

1.3.3DNA濃度的測定吸取10 μL樣品DNA，加TE雙蒸水200 μL，混勻，在紫外分光光度計上進行濃度測定。

1.3.4ISSR引物篩選從30份茉莉花材料中選取4個模板，在20 μL反應(yīng)體系中進行篩選。從100 條引物中篩選出10條擴增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定、信號強、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)。

1.3.5ISSR-PCR反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系，內(nèi)含10×buffer 2 μL DNA模板50 ng，引物濃度0.25 μmol·L^-1，dNTPs 0.15 μmol·L^-1，Taq DNA聚合酶1 U，Mg2+ 1.5 mmol·L^-1。在20 μL的PCR擴增產(chǎn)物中加入5 μL左右的6×loading buffer，混勻，1.5%～2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，以DL2000作為相對分子質(zhì)量標準，在4 V·cm-1恒壓下電泳4 h。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中攝像并保存圖像。

1.3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析ISSR是顯性標記，按照相同遷移位上有擴增帶記為1、無帶為0的方法記錄電泳譜帶，僅清晰、可重復(fù)的擴增帶才被記錄。得到的ISSR數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS軟件做進一步的分析。

2結(jié)果與分析

2.1DNA的提取和紫外吸收檢測

核酸的嘌呤、嘧啶中都有共軛雙鍵，對紫外光有強烈的吸收，天然雙鏈DNA在260 nm處的吸收值與280 nm處吸收值的比值(A260/A280)應(yīng)在1.80左右，低則說明制劑中蛋白質(zhì)可能未除盡，高則說明制劑中還有RNA。筆者用CTAB法提取的總DNA樣品大部分都呈現(xiàn)乳白色，少數(shù)幾個有顏色，可能是酚類物質(zhì)未去除干凈、材料出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，或是色素未去除干凈。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果見圖1，圖中顯示，DNA為一條清晰完整的帶，沒有明顯的拖尾，也沒有RNA帶，說明DNA片段大小較一致，純度高。在用CTAB法提取DNA的過程中，每一步操作是否把握得當以及所加試劑的量和濃度都會影響DNA的提取質(zhì)量。取材時應(yīng)取嫩葉，并立即冷凍保存。在用液氮研磨茉莉花葉片時，為了防止褐化，要盡可能快地磨碎，同時在提取緩沖液中加入β-巰基乙醇。此方法提取的DNA純度較高，可直接用于ISSR分析。

2.2茉莉花的ISSR遺傳多樣性

從上海鼎安生物科技公司合成的100條ISSR引物中篩選出10條條帶清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好且相對條帶較多的引物，10條引物的堿基序列及用于30份茉莉花材料基因組DNA的ISSR-PCR擴增的結(jié)果見表2。10條引物共檢測到70條DNA帶，其中34條為多態(tài)帶，多態(tài)性比率為48.57%，每條引物產(chǎn)生的多態(tài)性帶數(shù)在1～7之間。以上數(shù)據(jù)表明廣西橫縣茉莉花品種在分子水平上的遺傳多樣性是比較豐富的。其中引物887、807對茉莉花各品種基因組DNA的擴增結(jié)果見圖2、圖3。從電泳圖可以看出，30份材料的ISSR擴增產(chǎn)物電泳圖的條帶清晰，多態(tài)性較好，顯示出較好的遺傳多樣性。

2.3茉莉花品種的聚類分析

根據(jù)擴增結(jié)果，建立ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣后采用NTSYS軟件分析，得到茉莉花30份料的聚類分析樹狀圖(圖4)。在相似系數(shù)為0.86處，可明顯的將供試的30份茉莉花材料分為2個聚類組，在30份茉莉花材料中，相似性最大的為98%，相似性最小的也有86%。本試驗采取的材料均是橫縣當?shù)胤N植的材料以及扦插的后代，故它們之間相似性較高。有些品種的聚類分組與表型分類有些出入，可能是在引種過程中，品種基因組DNA發(fā)生了變異所致。

3討論

ISSR是一高度可變的DNA區(qū)域，有研究結(jié)果表明ISSR能比RAPD和同工酶產(chǎn)生更高比例的多態(tài)性帶型[5，6]，相對RAPD而言，ISSR使用的引物更長，一般都在15~24 bp，反應(yīng)的退火溫度為52～55℃，比RAPD的退火溫度36～40℃要高，因此對PCR反應(yīng)的敏感性低于RAPD，其穩(wěn)定性也較RAPD分析技術(shù)更高，具有更好的可重復(fù)性[7]。ISSR引物中包含有一定長度的重復(fù)序列，與它結(jié)合的目標序列在DNA復(fù)制的過程中存在滑動和不均等交換現(xiàn)象，使得它們在不同品種或個體間的重復(fù)次數(shù)存在較大差異，更易于導(dǎo)致引物結(jié)合位點和兩結(jié)合位點間的片段長度產(chǎn)生差異[8，9]。滑動也易引起背景模糊和條帶拖尾。試驗中用10條引物可將30份材料的DNA擴增出比較清晰的條帶，這些隨機引物的擴增信息，可在進一步的試驗中用于設(shè)計比較有效的特異引物來簡捷地對茉莉花品種的DNA多態(tài)性進行分析，甚至可能成為極具商業(yè)價值的分子標記，為茉莉花的遺傳育種和品種鑒定提供重要依據(jù)。通過聚類分析，所得結(jié)果與茉莉花在形態(tài)學上的分類基本符合，只有幾個品種的分類有一定的差異，充分顯示應(yīng)用ISSR技術(shù)可以有效地進行品種鑒別，以及為茉莉花新品種選育的早期選擇及雜交親本的選配提供依據(jù)、實現(xiàn)分子標記輔助育種等。在生產(chǎn)實際中，還可為保護茉莉花育種產(chǎn)權(quán)、登記新品種、鑒定和檢測種苗的真實性與純度、仲裁苗木糾紛等提供客觀、科學的技術(shù)保障。

參考文獻：

[1]董利娟，張曙光.茉莉花的生產(chǎn)現(xiàn)狀與科研方向[J]. 茶葉通訊，2001(2)：11-13.

[2]ZIEDEWIEZ E， RAFALSKI A， LABUDA D. Genome fingerprinting by simples equence repeats(SSR)-anhored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20： 176-183.

[3]NAGOKA T，OGIHARA.Y. Application of inter-simple sequence repeat polymorphism in wheat for use of DNA markers in comrarision to RFLP and RAPD markers[J]. Theor Appl Genet，1997，94：597-602.

[4]賈繼增. 分子標記種質(zhì)資源鑒定和分子標記育種[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，1996，29(4)：1-10.

[5]宣繼萍，章鎮(zhèn)，房經(jīng)貴，等. 蘋果品種ISSR指紋圖譜構(gòu)建[J]. 果樹學報，2002，19(6)：421-423.

[6]錢韋，葛頌，洪德元. 采用RAPD和ISSR標記探討中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[J].植物學報，2000，42(7)：741-750.

[7]GE X J，SUN M. Reproductive biology and genetic diversity of a cryptoviviparous mangrove Aegiceras corniculatum (Myrtinaceae) using allozyme and inter simple sequence repeat(ISSR)analysis[J]. Molecular Ecology，1999，8：2061-2069.

[8]CAMACHO F J， LISTON A. Population structure and genetic diversity of Botrychium pumicola (Ophioglossaceae) based on inter-simple sequence repeats(ISSR)[J]. Am J Bot，2001，88(6)：1065-1070.沈仁僅.基礎(chǔ)生物化學[M].上海：上海科學技術(shù)出版社，1980. 146-147.