季節對超數排卵兔卵母細胞數量及質量的影響

摘要：用孕馬血清促性腺激素PMSG配合人絨毛膜促性腺激素hCG處理中國白兔，對4個季節超排兔卵母細胞的數量和孤雌胚胎以及卵胞漿內精子注射(ICSI)胚胎的體外發育能力進行了評定。結果表明，春季成熟卵母細胞的獲得數量顯著高于冬季(P<0.05)，而其他季節之間差異不顯著(P>0.05)；兩種卵子(孤雌激活和ICSI)的卵裂率不受季節影響(P>0.05)，但夏季兩種胚胎的囊胚形成能力顯著低于其他3個季節(P<0.05)。所以，季節既影響超數排卵兔的卵母細胞數，也影響卵母細胞的質量。

關鍵詞：兔；超數排卵；卵胞漿內精子注射；季節

中圖分類號：S829.1；S814.4文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0747-04

Effects of Seasons on Number and Quality of Superovulated Rabbits

LI Qiu-yan，GUO Ying，YAN Feng-xiang，CHEN Yong-fu，AN Xiao-rong

(State Key Laboratory for Agrobiotechnology/College of Biological Science， China Agricultural University， Beijing 100094， China)

Abstract： The objective of this study was to test effects of season on number and quality of oocytes derived from superovulated rabbits. The China white rabbit were superovulated with PMSG companied by hCG. The oocyte number and in vitro developmental ability of oocytes parthenogenetic embryo and ICSI were evaluated in four seasons. These results indicated that the mature oocyte number was higher in spring than that in winter (P<0.05)， and there were no differences among other seasons (P>0.05). The cleavage rate of two kinds oocyes (parthenogenetic activated and ICSI) was not affected by season； but the competence of blastocyst formation was lower in summer than that in any of other three seasons (P<0.05). In conclusion， season affected both quantity and quality of superovulated rabbit’s oocytes.

Key words： rabbit； superovulation；ICSI；seasons

兔作為試驗動物，具有體型適中、繁殖周期短、容易操作和誘導排卵等特點，所以是科學研究中最常用的模型動物之一[1，2]。它還可以用做乳腺生物反應器生產醫用蛋白[3，4]，同時也是受精和發育等基礎研究領域常用的試驗動物，因為兔的排卵時間可以確定，卵質比羊、牛、豬的透明，能夠清楚地看到原核，又不像小鼠卵的卵質那樣脆弱。轉基因、克隆、ICSI等繁殖技術都需要大量卵母細胞或早期受精卵(原核注射轉基因方法)，而獲得優質的卵母細胞是相關研究的最基本條件。兔的超數排卵受多種因素的影響，如激素種類[5，6]、劑量[7，8]、處理方法[9]、季節[10，11]、動物品種[6，12]、年齡[13，14]和體重[15]等。在生產中發現，季節影響兔的自然繁殖能力。在炎熱的夏季和寒冷的冬季，母兔的發情、懷孕和產仔數都顯著降低[16]。有研究報道，春季超數排卵處理兔的胚胎回收數量顯著高于秋季[17]，但季節對所得卵母細胞的質量即體外發育能力的影響這方面的報道很少。本研究的目的是探討不同季節兔的超數排卵效果是否存在差異，并通過卵母細胞的孤雌發育和顯微受精后的體外發育能力，比較不同季節之間卵母細胞的質量是否存在差異，以期豐富兔的繁殖性能方面的資料。

1材料與方法

1.1動物與試劑

試驗所用兔的健康狀況良好，單籠飼養，自由采食全價商品顆粒飼料，自然采光，室內溫度控制在14～30℃。所用試劑除特別說明外，均購自Sigma公司。M199購自Gibco，胎牛血清(FBS)購自Hyclone，促卵泡素(FSH))購自中國科學院動物研究所，孕馬血清促性腺激素(PMSG)購自天津華孚高新生物技術公司，人絨毛膜促性腺激素(hCG)購自寧波生物制品公司。

1.2精子的準備

用假陰道法人工采集公兔的精液，并在采集后半小時內進行精液處理。先將精液置于1.5 mL的離心管中，2 000 r·min^-1離心5 min，然后棄上清。再用移液槍把離心沉淀物轉移到另一支4 mL的離心管底部，緩慢加入2 mL預熱的M199溶液，置于培養箱中孵育30 min。最后，在顯微鏡下檢查精子密度和活力，小心吸取上游的潔凈精子懸浮液，放入另一支1.5 mL 離心管中，室溫下離心洗滌2次。然后用操作液稀釋成1×106·mL^-1濃度，每個凍存管中放入20 μL精子，旋緊蓋子，置于液氮中冷凍。顯微受精操作前，從液氮中取出凍存管，于25℃水浴解凍。解凍后的精子與PVP混合做成精子滴。

1.3卵母細胞的準備

皮下注射PMSG 1次，劑量為每只130 IU。間隔時間72 h后，耳緣靜脈每只再注射hCG130 IU。13～15 h后采集卵丘卵母細胞團，活體取卵時，用戍巴比妥鈉作全身麻醉，劑量為40 mg·kg-1。手術保定、術部刮毛、消毒，沿腹中線打開腹腔，找出子宮，沿子宮角尋找一側輸卵管和卵巢，用4 mL H199 (20 mmol HEPES緩沖的M199)液沖出兩側輸卵管內的排卵團。另一種取卵方法是直接處死超排母兔，無菌操作剪下輸卵管和卵巢，沖出排卵團。將排卵團放入含0.1%透明質酸酶的H199溶液中消化3～5 min，用移液槍反復吹打，去除卵母細胞周圍的顆粒細胞。

1.4卵母細胞的孤雌激活

挑取形態正常、排除第1極體的成熟卵母細胞進行孤雌激活處理，激活劑為離子霉素、6-DMAP和放線菌酮(CHX)。卵母細胞首先用5 μmol·L^-1離子霉素處理5 min，然后再放入含有2 mmol·L^-1濃度的6-DMAP和10 μg·mL^-1CHX的培養液中輔助激活4 h。

1.5卵胞漿內精子注射(ICSI)

從凍存管(解凍后)中取2.5 μL精子懸浮液，注入7.5 μLPVP濃度為12%的H199液滴中，用移液槍反復吹打數次，使單個精子均勻地分布于粘稠的PVP溶液中。取10～15枚卵子置于另一個含H199溶液的液滴，注射精子的操作在此液滴進行。卵子在溶液中平衡1～2 min之后，開始注射精子。注射時選擇形態正常的精子，從尾部把精子吸入注射針，每次吸入3～5個精子。移動顯微鏡的載物臺，使持卵針和注射針移入放置卵子的液滴并開始注射，用持卵針固定一枚卵母細胞，通過轉動，使其在9點鐘的部位被固定，這時第1極體處在6點鐘或12點鐘的位置。推動注射針，刺破透明帶和卵的質膜，然后將精子注射到卵質內，并盡可能地減少操作液被帶入卵內的量。

1.6胚胎的體外培養

完成精子注射或孤雌激活后的卵母細胞，用平衡過的M199培養液[18]洗滌2～3次，然后放入石蠟油覆蓋的培養小滴中，培養滴的大小為50 μL左右，每滴內所培養的卵子不超過30枚。培養環境為38.5℃、含5%CO2飽和濕度的空氣。注射卵的卵裂率在ICSI后18～24 h觀察，丟棄未分裂的卵子，剩下的受精卵繼續培養，3 d后統計囊胚形成率。

1.7試驗設計

1.7.1季節對家兔超排效果的影響所有超排兔均購自同一動物中心，購買后至少飼養2周再開始用于試驗。超排使用激素的生產廠家、批次和劑量都相同，每次處理3～4只供體兔，記錄每次從輸卵管獲得的成熟卵母細胞數量。試驗結果按春夏秋冬4個組進行統計。

1.7.2季節對兔孤雌胚胎體外發育能力的影響每次超數排卵得到的卵母細胞，將其中少部分(約1/5)用于孤雌激活試驗。在孤雌激活方法相同的條件下，觀察卵母細胞的卵裂率和體外培養的囊胚發育情況。并按春夏秋冬進行分組統計。

1.7.3季節對兔ICSI胚胎體外發育能力的影響挑選形態正常的成熟卵母細胞進行顯微受精，無冷凍保護劑液氮凍融的單個精子注射到卵母細胞的胞質內。所有試驗用的注射精子都來自相同的精子供體。注射精子后的卵母細胞進行體外培養，記錄卵裂率和囊胚形成率。比較ICSI卵母細胞在不同季節的體外發育情況。

1.8統計分析

試驗數據用SPSS軟件(11.5.0版，SPSS Inc. USA)進行處理，結果用ANOVO方法進行統計學分析。

2結果與分析

2.1季節對家兔超排效果的影響

在比較季節對家兔超排效果的影響時，我們把體重在2.5～3.0 kg之間、年齡在5月齡左右的青年母兔，分別按春(3月中至5月中)、夏(6月中至8月中)、秋(9月中至11月中)和冬(12月中至2月中)4個季節統計排卵數，結果如表1所示。家兔在春、夏、秋、冬4個季節的平均排卵數分別為30.5±2.3、25.5±1.9、24.2±2.8和23.4±2.2枚，春季兔的超數排卵效果顯著好于冬季(P<0.05)；春、夏、秋和夏、秋、冬3個季節之間兔的排卵數沒有顯著差異。

2.2季節對兔孤雌胚胎體外發育能力的影響

兔孤雌胚胎在不同季節的發育結果如表2所示，從表2可見，季節對卵裂率沒有影響(P>0.05)，但夏季孤雌胚胎的囊胚發育力比其他3個季節顯著降低(P<0.05)，春、秋和冬季之間的囊胚率差異不顯著(P>0.05)。

2.3季節對兔ICSI胚胎體外發育能力的影響

兔ICSI胚胎的發育結果見表3，由表3可見，在不同的季節，ICSI卵的卵裂率沒有顯著的差異(P>0.05)，但與春、秋、冬3個季節相比，夏季的顯微受精胚胎的囊胚發育能力顯著下降(P<0.05)，春、秋和冬季之間的囊胚率差異不顯著(P>0.05)。

3討論

家兔屬于常年發情動物，雖然一年四季都可以配種繁殖，但是溫度、營養狀況等因素對兔的繁殖性能會產生一定的影響。尤其是炎熱的夏季和寒冷的冬季，舍溫高于30℃和低于5℃都會嚴重影響兔的繁殖能力，公兔表現為精子質量下降，母兔表現為發情率、妊娠率降低，產仔數量減少。本研究比較了超數排卵處理兔在不同季節排出卵母細胞數量的情況，結果表明，春季超數排卵處理，使兔的平均排卵數顯著高于冬季，其他季節之間雖然平均排卵數量不同，但并沒有統計學上的差異。前人關于季節對兔超數排卵影響的試驗結果也不盡相同，有報道顯示，兔在春季的超數排卵效果明顯優于秋季[5，10]，其結果與本試驗不同。而向天浩等[11]對兔的超數排卵研究中發現春秋兩個季節之間差異不顯著，與我們的結果一致。不同的地理位置兔的超數排卵效果可能也存在差異，有研究者在昆明地區進行試驗，發現季節變換不影響兔的超數排卵效果。本試驗中夏季兔的超數排卵數量與其他季節沒有顯著差異，與向天浩等[11]的結果不同。原因可能是本試驗中對兔舍環境溫度進行了一定的控制(不超過30℃)，使試驗兔在北京的炎熱夏季里沒有受到嚴重的高溫應激。

本研究在兔卵母細胞孤雌激活的試驗中，4個季節都獲得了比較高的卵裂率，雖然春季的卵裂率比最低的夏季高出近5個百分點，但沒有統計學上的差異。說明盡管夏冬兩個季節的氣候條件比另外兩個季節稍差，但其卵母細胞在早期孤雌發育的卵裂率上并沒有表現出差異來。經過體外進一步的培養，我們發現孤雌激活卵母細胞的囊胚發育率在夏季受到明顯的影響，表明夏季氣候條件的應激會促使卵母細胞體外發育能力的下降，與兔自然繁殖時所表現的結果相似。關于本試驗中冬季仍然能獲得很好囊胚發育率的結果主要有2個原因，首先是兔舍內安裝了暖氣，始終保持了14℃以上的室溫；另外，試驗兔全年飼喂全價飼料，不存在農戶傳統養兔冬季飼料營養缺乏的問題。

卵齡、精子狀態、注射方法等都是影響顯微受精的因素，本試驗首次進行了季節對兔顯微受精胚胎體外發育能力影響的研究。與孤雌激活發育的數據相比，卵裂率和囊胚發育率都比較低，其原因主要是注射損傷、體外滯留時間較長、精子對卵母細胞的激活不充分所致。季節對ICSI胚胎影響的規律與孤雌發育的結果一致，充分證明了季節變化可以影響卵母細胞的質量，夏季的高溫應激使胚胎的發育能力下降；從本試驗的結果可以推測，在冬季，如果能夠保證充足的營養和適當提高兔舍的溫度，同樣能夠獲得較好的繁殖效果。從試驗結果可以看出，不論是卵母細胞數量，還是胚胎的卵裂率和囊胚率，都是春天的最好。

總之，季節可以影響超數排卵兔卵母細胞的獲得數量，且冬季顯著低于其他季節；孤雌激活和ICSI卵母細胞的卵裂率不受季節變換的影響，但它們體外培養時的囊胚發育能力都表現為夏季最差，顯著低于其他3個季節。

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