尼羅羅非魚Ｄｍｒｔ１基因克隆及在不同組織中的表達

摘要：Dmrt1基因是Dmrt基因家族的一個重要成員，在動物性別決定過程中發揮重要作用。參照小鼠Dmrt1基因DM保守區及有關文獻，設計了1對簡并引物，擴增了尼羅羅非魚的Dmrt1基因，并對擴增產物進行了亞克隆與測序。結果在雌雄尼羅羅非魚個體中各獲得1個預期的基因片段，長度為140bp，序列無性別差異。序列同源性分析表明，尼羅羅非魚Dmrtl基因DM盒區核苷酸序列與人和鼠相應基因的同源性為78%；編碼的氨基酸序列與人和鼠相應基因編碼序列的同源性為89%，充分顯示了Dmrt1基因在進化上的高度保守性。進一步根據獲得的Dmrt1序列，設計1對特異引物，采用RT-PCR技術對尼羅羅非魚不同組織Dmrt1基因的表達進行了研究。結果發現，Dmrt1只在精巢中特異表達，在卵巢、眼、腸、鰓及心臟組織中無表達，提示該基因在性別分化和功能維持上可能具有重要作用。

關鍵詞：尼羅羅非魚；Dmrt1；RT-PCR

中圖分類號：S965.125；Q785；Q786文獻標識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0754-04

Cloning of Dmrt1 Gene and Its Expression in Different Tissues of Oreochromis niloticus

YANG Dong，YU Lai-ning

(College of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，China)

Abstract：The Dmrt1 gene plays important roles in sex determination. The 140bp DM -box of Dmrt1 gene in Oreochromis niloticus was amplified by using degenerated PCR，and then subcloned and sequenced.The sequences from male and female O. niloticus were compeletely identica1.Compared with the human and mouse Dmrt1 gene，the sequences of Dmrt1 shared 77%nucleotide homology and 89% amino acid indentity. The results indicated that Dmrt1 genes were highly conservative in phylogeny. According the sequence of Dmrt1， specific primers were designed for RT-PCR in different tissues in adult O. niloticus. Dmrt1 expression was only detectable in testis， and no expression was detected by RT - PCR in the following tissues： ovary， eye， intestine， gill and heart.

Key words： Oreochromis niloticus； Dmrt1；RT-PCR

Dmrt是一種目前已知最保守的性別分化相關基因，該家族成員與果蠅的性別決定基因Doublesex (dsx)和線蟲性別決定基因(Mab-3)一樣，編碼的蛋白質都包含一個具有DNA結合能力的保守基序，即DM(doublesex and mab-3)結構域，并以鋅指結構與特異DNA序列相結合，在性別決定和分化發育中起調控作用[1，2]。目前已在爬行類、鳥類及哺乳類動物中檢測到DM盒基因的存在，充分表明該基因在脊椎動物進化過程中的高度保守性[3，4]。迄今為止，在人類及其他動物中已克隆的Dmrt家族成員約有10個[5]。而對其功能的研究則主要集中在Dmrt1-4，其中Dmrt1廣泛參與了脊椎動物的雄性性別決定與分化過程[6]。鑒于Dmrt1基因在性別決定及發育中的重要作用，進一步對其參與調控的分子機制進行研究有重要意義。

脊椎動物系統進化中，魚類處于承先啟后的地位，對其Dmrt基因的研究，將有助于闡明從低等無脊椎動物到脊椎動物乃至人類的性別決定機制的進化。尼羅羅非魚是世界性的主要養殖對象之一，也是分析性染色體進化的一個重要模型。為了探討Dmrt基因家族在魚類中的保守性，本文以尼羅羅非魚為材料，采用簡并PCR，擴增并克隆了尼羅羅非魚基因組中的DM結構域；采用RT-PCR技術對尼羅羅非魚的不同組織Dmrt1的表達進行了研究。

1材料與方法

1.1材料

尼羅羅非魚采自中國水產科學研究院長江水產研究所尼羅羅非魚原種魚場(湖北荊州，1978年長江水產研究所從蘇丹引進)，經活體解剖鑒定為性成熟個體。

1.2基因組DNA提取

取肌肉組織，按常規方法提取基因組DNA[7]。

1.3簡并PCR

設計以下簡并PCR 引物用于擴增Dmrt保守區域：上游引物：5′-TGCCCAAGTGCTC(TC)CG(CG)TG(TC)(AC)GGA-3′，下游引物：5′-CCTG(G

AC)GCCGCCAT(GA)ACTCT-3′。該引物曾成功擴增出小鼠的Dmrt1基因，50 μL的反應體系中含有2 μL DNA產物，5 μL10×PCR緩沖液，1.5mol·L^-1 MgCl2溶液，0.2 mol·L^-1dNTPs 溶液，上下游引物各0.8mmol·L^-1，2.5 U TaqDNA聚合酶(大連TaKaRa公司產品)。PCR反應條件：在94℃預變性5 min，隨后在94℃反應30 s，在59℃反應30 s，在72℃反應

1 min，循環35次，最后在72℃延伸10 min。

1.4PCR產物的克隆、測序及序列分析

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收和DNA凝膠回收試劑盒純化后，克隆在pGEMR-T Easy質粒載體上(上海生物工程公司產品)，再將重組體克隆轉化到感受態大腸桿菌(Escherichia coli)中，通過藍、白斑篩選，將陽性克隆進行擴大培養，純化重組質粒DNA。以M13引物在Megbase 1000測序儀上測序。將測得的cDNA片段翻譯成氨基酸序列，并用BLAST軟件進行同源性比較和分析。

1.5總RNA的提取

用Trizol試劑(Invit rogen公司產品)對尼羅羅非魚的精巢、卵巢、眼、腸、鰓及心臟提取總RNA。將樣品置于研缽中，用液氮碾碎，加入適量Trizol試劑，研磨混勻，待凍融后轉入1.5 mL Eppendorf管中，用氯仿抽提，異丙醇沉淀，75%(V/V)乙醇洗滌，最后溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的無菌水中，在-70℃下保存。

1.6第1鏈cDNA合成

取1支0.2 mL的PCR薄壁管，依次加入1 μL總RNA溶液、1 μL Oligo(dT)15溶液(Promega公司產品)、6 μL經DEPC處理過的無菌水，于70℃水浴5 min和冰浴2 min后加入4 μL 5×第1鏈反應緩沖液，2 μL 10 mmol·L^-1的DTT，4 μL0.2 mol·L^-1的dNTPs，1 μL RNasin溶液(40 U·mL^-1，大連TaKaRa公司產品)。將上述混合物置于42℃水浴中2 min后，加入1 μL SuperScriptП反轉錄酶(200 U·mL^-1，Invit rogen公司產品)，在42℃空氣浴1 h，于70℃水浴15 min后終止反應，在-20℃下保存。

1.7RT-PCR

各種組織均取1 μg總RNA逆轉錄為cDNA。取1 μL cDNA產物進行PCR。PCR引物為根據已知DMRT1基因cDNA序列設計的1對引物，上游引物5′-GCCCAAGTGCTCTCGGTGTA-3′，下游引物5′-AAGGAGGCTGCCATGGTCTCA-3′。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環30次；72℃延伸10 min。根據β-actin基因序列(未發表)設計1對引物，上游引物5′-GAGAAGCTGTGCTATGTCGC-3′，下游引物5′-TAAGTCCCCAGATGCAAC-3′。利用該引物進行PCR 作為內源參照物。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環26次；72℃延伸10 min。取10 μL PCR產物電泳，EB染色，數碼凝膠成像系統拍照。

2結果與分析

2.1基因組DNA擴增結果

以雌雄尼羅羅非魚基因組DNA為模板，采用簡并引物D1，D2，PCR擴增獲得長約100 bp的PCR產物(圖1)，說明在尼羅羅非魚基因組中也存在Dmrt基因，且雌雄無差異。

2.2克隆產物的鑒定

用目的片段與pGEMR-T Easy質粒載體的連接體系轉化JM 101。轉化后在涂有IPTG和X-gal的Amp LB平板上37℃培養細菌。由于重組質粒中β-半乳糖苷酶基因已被破壞，已轉化的JM 101細菌不能分解X-gal，因而含重組質粒的菌落在培養板上呈白色。轉化后藍斑約為30%，白斑約為70%，與陽性對照(control DNA)相差不大，陰性對照(未加目的的PCR產物)中約有20多個藍斑，沒有白斑。菌落PCR擴增結果表明，克隆后的白色菌落中80%以上都是陽性克隆(圖2)。

2.3RT-PCR結果

以尼羅羅非魚不同組織的cDNA為模板，以特異引物D3，D4對其進行RT-PCR，另以β-actin基因的1對特異引物H1、H2進行RT-PCR，做參照，兩種PCR產物混合電泳，結果在精巢中除有的預期的長180bp的β-actin基因擴增產物外，同時還發現Dmrt1(140 bp)的表達，在其他4種組織中在雌雄個體中都未檢測到Dmrt1基因的表達，只有β-actin基因表達，結果如圖3。

2.4序列分析

尼羅羅非魚Dmrt1基因的DM-domain與奧利亞羅非魚(O. aurea)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、青鳉(Oryzias latipes)、新月魚(Xiphophorus maculatus)、人、小鼠等動物的Dmrt1基因的DM-domain序列和尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚的DMO基因的DM-domain序列進行比較，核苷酸同源性分別為98.6%、87.9%、81.4%、82.1%，、77.9%、77.1%、72.1%和72.1%，氨基酸同源性分別為100%、97.8%、87.0%、87.0%、89.1%、89.1%、84.8%和84.8%。各物種DMO，Dmrt1的Gene bank號分別為：奧利亞Dmrt1(AF534541)，虹鱒Dmrt1(AF209095)，青鳉Dmrt1(AY448017)，新月魚Dmrt1(AF529187)，人類Dmrt1(AY442914)，小鼠Dmrt1(AY169789)，尼羅羅非魚DMO(AF203490)，奧利亞羅非魚DMO(AY487938)。

3討論

3.1Dmrt1基因的保守性分析

在果蠅的性別決定基因Doublesex和線蟲基因Mab-3中首先發現了1個共有的DM結構域后，已在甲殼類、魚類、爬行類、鳥類、哺乳類等動物中檢測到Dmrt基因。為了探討該家族的保守性，本研究采用簡并PCR方法，對尼羅羅非魚基因組進行擴增，獲得長140 bp的擴增帶。同源性比較發現，尼羅羅非魚Dmrt1與進化位置不同的各類動物相應基因及其編碼的氨基酸序列都具有高度同源性。如圖5，尼羅羅非魚Dmrt1基因的核苷酸序列與人和鼠的Dmrt1同源性高達77.9%和77.1%；其氨基酸水平與人和鼠的Dmrt1同源性高達89.1%，與虹鱒高達97.8%，與奧利亞羅非魚高達100%[8]。因此，這個Dmrt序列可能是人、鼠的Dmrt1基因的直向同源基因(Orthologues)。此外，氨基酸序列的保守性也暗示了Dmrt1基因功能上的高度保守性。保守位點的存在對于其功能的維持可能起著至關重要的作用，保守位點中第7和16位的His位點以及第21、26、28和31位Cys位點可能是形成C2/H2型鋅指結構的基礎。

3.2Dmrt1基因的表達與性別的分化發育

盡管Dmrt1基因是目前已知的在各個進化地位的物種中都參與了性別發育過程的基因，但是它在不同進化地位、具有不同性別發育機制的不同物種在性別發育過程中所發揮的功能不盡相同。

在人類，Dmrt1基因位于與性別反轉密切相關的常染色體區域9p24.3[1]，Dmrt1的表達模式類似于SRY，它在性別分化前只在生殖嵴中特異表達，以后也只在睪丸中表達。在小鼠中，Dmrt1基因位于與人的9 p染色體的遠端有保守同線性的19號染色體的中部[9]。研究表明在成年的小鼠中，Dmrt1只在睪丸中表達，而卵巢和其他的器官中無表達。

魚類的性別決定形式更為原始，性別決定的機制也更為多樣。本文的RT-PCR結果發現，Dmrt1基因僅在成體睪丸中表達，表明其可能參與了精子的形成過程，而在其他組織中無表達，說明Dmrt1基因在器官的發育及功能維持上不具有直接的作用。對虹鱒的Dmrt1基因的表達研究發現[10]，其在精巢的分化過程中高表達，而在卵巢的分化過程中則沒有表達。用激素誘導其產生單性的全雌或全雄的個體中，遺傳雄性的個體轉變為生理雌性的個體時，Dmrt1基因的表達量下調，而遺傳雌性的個體轉變為生理雄性的個體時，可能由于激素誘導的時效性，Dmrt1基因的表達量并沒有上調。在青鳉中，性別決定期的性腺中未檢測到Dmrt1的表達；在成體組織中，Dmrt1也只在精巢中表達[11]。上述結果的表明，與其他脊椎動物中的功能一樣，在魚類中，Dmrt1是一個性別分化基因，與精巢的形成和功能維持有關[11]。

參考文獻：

[1]RAYMOND C S，SHAMU.C E，SHEN M M，et al. Evidence for evolutionary conserva -tion of sex - determining genes [J].Nature，1998，391，691-695.

[2]GRANDI A D，CALVARI V，BERTINI V，etal. The expression pattern of a mouse doublesex-related gene is consistent with a role in gonadal differentiation[J]. Mechanisms of Development，2000，90(2)：323-326.

[3]SMITH C A，MCCLIVE P J，WESTEM P S， et al. Conservation of a sex-determing Gene[J]. Nature，1999，402：601-602.

[4]RENLL，CHENGHH，GUO Y Q，et al. Evolutionary conservation of Dmrt gene family in amphibians reptiles and birds[J].Chinese Science Bulletin ，2001，46 (23)：1992-1996.

[5]任莉莉，程漢華，郭一清. 兩棲類爬行類和鳥類存在一個新的Dmrt 基因家族[J]. 科學通報，2001，46(14)：1187-1190.

[6]ORIANE MARCHAND，MARINA GOVOROUN，HELENA D， et al. Dmrt1 expression during gona -dal differentiation and spermatogenesis in the rambow trout，Oncorhynchus mykiss[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2000，1493：180-187.

[7]SAMBROOK J，DAVIDM RUSSELL. Molecular Cloning： A Laboratory Mannual[M]. 3 rd ed. NewYork：Cold Sp ring Harbor Laboratory Press，2001.

[8]王光花，吳婷婷，岳斌. 奧利亞羅非魚性別相關基因DMRT1克隆及其分析[J].萊陽農學院學報(自然科學版)，2006，23(1)：37-40.

[9]RAYMOND C S，PARKER E D.KETTLEWELL J R.et al. A region of human chromosome 9p required for testis development contains two genes related to known sexual regulations[J]. Human Mol Genetics，1999，8：989-996.

[10]MARCHAND O，GOROROUN M，DCOTTA H，et al. DMRT1 expression duringgonadal differentiation andspermat ogenesis in the rainbow trout，Oncorchynchus mykiss[J]. Biochim Biophys Acta，2000，1493：180-187.

[11]BRUNNER B，HORNUNG U，SHAN Z，et al. Genomic organization and exp ression of the Doublesex2relatedgene cluster in vertebrates and detection of putative regulat ory regions for DMR T1[J]. Genomics，2001，77：8-17.