一株降解苯酚微生物的分離與鑒定

摘要：從武漢市某化工廠的活性污泥中分離1株能以苯酚為惟一碳源和能源生長的菌株，命名為CY1。通過逐級馴化，CY1可在含1 000 mg·L^-1苯酚的培養(yǎng)基中降解苯酚并生長。經(jīng)對該菌株進行形態(tài)特征以及16S rDNA序列比對分析，確認(rèn)該菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。

關(guān)鍵詞：苯酚；降解；假單孢菌屬

中圖分類號：S154.3文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114(2008)07-0792-02

Isolation and Identification of A Phenol-degrading Bacterium

CHENG Guo-jun1，YANG Kai1，LI You-guo2

(1.College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China；

2.State Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， 430070， China)

Abstract：A strain CY1 was isolated from the sludge around a chemical plant in Wuhan， Hubei Province. It had ability of utilizing phenol as sole carbon and energy sources. By using step-by-step domesticating method， it could grow in the culture medium byusing 1 000 mg·L^-1 phenol as sole carbon source. CY1 was considered to be belonged to Pseudomonas by morphological characteristics and the phylogenetical analysis of the 16S rDNA sequence.

Key words： phenol； degradation；Pseudomonas

苯酚及其衍生物廣泛應(yīng)用于制藥、農(nóng)藥、冶金、塑料等行業(yè)，它在環(huán)境中能與水中的氯作用生成毒性更大的氯代酚，對人類健康和動植物生長造成的危害不容忽視[1]。近年來，苯酚降解微生物的研究倍受關(guān)注，已鑒定和發(fā)現(xiàn)了多種具有苯酚降解能力的菌株，比如根瘤菌(Rhizobia)、乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、假單胞菌(Pseudo-monas sp.)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)、酵母菌(Yeasttri-chosporon cutaneum)、反硝化菌等[2]。本研究從湖北武漢某化工廠的活性污泥中馴化、篩選到一株苯酚降解細(xì)菌，并根據(jù)其16S rDNA基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，對其進行了鑒定。同時對苯酚的存在對菌株生長的影響進行了研究。

1材料與方法

1.1材料

污泥樣品：采自湖北武漢某化工廠污水排放口。培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2。篩選培養(yǎng)基：(NH₄)2SO₄ 2.0 g·L^-1，MgSO₄ 0.2 g·L^-1，無水CaCl2 0.1 g·L^-1，K₂HPO₄ 0.5 g·L^-1，NaH2PO₄ 0.5 g·L^-1，加入苯酚使其終濃度分別為300、500、700、900、1 000 mg·L^-1，pH值6.5～7.5[1]。

1.2方法

1)苯酚降解微生物的富集、馴化將采集的樣品接種于富集培養(yǎng)基中，加入苯酚使其終濃度為200 mg·L^-1，于30℃搖床內(nèi)振蕩培養(yǎng)。待菌體長出后，按2%的接種量轉(zhuǎn)移到液體的篩選培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接5次，培養(yǎng)基中的苯酚分別按300、500、700、9 00、1 000 mg·L^-1等濃度逐漸適量遞增，完成菌株的馴化過程[3]。

2)苯酚降解微生物的分離將上述經(jīng)過馴化的菌液用平板稀釋法涂布于含苯酚為1 000 mg·L^-1的篩選培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48 h后獲得單菌落。

3)16S rDNA基因擴增、序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析將菌體震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，抽提細(xì)菌基因組總DNA。通過PCR方法從細(xì)菌基因組中擴增其16S rDNA。擴增所用引物分別為：引物1(5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′)和引物2(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)。PCR反應(yīng)(100 μL)體系為：基因組總DNA 3 μL、10 mmol·L^-1引物1和引物2各2 μL，10×Buffer(含Mg2+)10 μL，5 U·μL^-1 Taq聚合酶1μL，無菌去離子水77 μL。反應(yīng)為30個循環(huán)：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火1 min，72℃延伸2 min；30個循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)用瓊脂糖凝膠回收后，克隆到大連寶生物公司的pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[4]的感受態(tài)細(xì)胞。16S rDNA的測序工作由北京三博遠(yuǎn)志公司完成。通過Blast程序，將測得的16S rDNA序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行相似性比較分析。同時選取同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹分析采用RDPⅡ的Phylip Interface程序進行。

4)細(xì)菌生長曲線的測定將對數(shù)生長期的菌株按2%分別接種到不含苯酚以及含有500 mg·L^-1苯酚的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，分別在0、12、24、36、48、60、72 h后取樣，用分光光度計于600 nm處測定光吸收值(OD)。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌的篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)、馴化，從樣品中分離到1株能在苯酚濃度為1 000 mg·L^-1的條件下良好生長的菌株，命名為CY1。CY1在篩選培養(yǎng)基上菌落較小、白色不透明、邊緣整齊、圓形中央突起。鏡檢結(jié)果為單細(xì)胞桿狀、無芽孢、革蘭氏染色陰性。

2.2細(xì)菌的鑒定

將CY1菌株的16S rDNA部分序列通過Internet網(wǎng)與GenBank基因庫中所有已知的16S rDNA序列進行了同源性比較，結(jié)果其與Pseudomonas屬中多個菌株的序列相似性都達(dá)到了99%。其中，熒光假單胞菌(P. fluorescens)和惡臭假單胞菌(P. putida)具有降解苯酚的能力[5]。

2.3系統(tǒng)發(fā)育分析

從系統(tǒng)進化樹(圖1)可以看出CY1菌株與Pseudomonas fluorescens strain FLM05-2、Pseudomonas sp. Antarctic IS02、Pseudomonas trivialis strain BIHB 747、 Pseudomonas graminis KFC-45歸于同一簇群，與其他的菌株如Pseudomonas putida

strain SH₄1、Pseudomonas chlororaphis、Burkholderia cepacia strain ATCC 53795、Burkholderia cepacia JT25等之間有比較大的差異。結(jié)合菌株的形態(tài)和16S rDNA部分序列比對結(jié)果，可確定菌株CY1屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)。而在系統(tǒng)發(fā)育地位上則屬于Bacteria； Proteobacteria； Gammaproteobacteria； Pseudomonadales； Pseudomonadaceae； Pseudomonas。

在30℃條件下，將菌株CY1分別接種到不含苯酚以及含有500 g·L^-1苯酚的LB培養(yǎng)液中，分別在0、12、24、36、48、60、72 h后取樣，測定OD600nm值，然后繪制生長曲線(圖2)，500 mg·L^-1的苯酚對細(xì)菌生長有明顯的抑制作用，與對照相比，細(xì)菌的生長量在72h內(nèi)明顯減少。

3小結(jié)

從湖北武漢某化工廠污水排放口的污泥樣品中分離到1株苯酚降解的菌株CY1，經(jīng)過馴化，該菌株可以在含1 000 mg·L^-1苯酚的惟一碳源培養(yǎng)基中生長。根據(jù)其菌落特征、個體形態(tài)特征以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育學(xué)結(jié)果，該菌屬于假單胞菌屬。500 mg·L^-1的苯酚對細(xì)菌生長有明顯的抑制作用，同時在一定時間內(nèi)細(xì)菌的生長量顯著減少。

參考文獻：

[1]楊光，向陽，夏雷.一株苯酚高效降解菌的分離及其分解能力的初步研究[J]. 氨基酸和生物資源，2003，25(4)：3-6.

[2]張巍，楊翔華.苯酚降解菌的分離及特性[J].遼寧石油化工大學(xué)學(xué)報，2004，24(1)：5-7.

[3]季祥，蔡祿. 高效苯酚降解菌的分離和鑒定[J]. 包頭鋼鐵學(xué)院學(xué)報，2006，25(4)：368-370.

[4]SAMBROOK J， FRITCH E F， MANIATIS T. Molecular Cloning： A laboratory manual[M]. 2nd editon. NY： Cold Spring Harbor Labo-ratory，1989.

[5]向述榮，林敏.苯酚的生物降解基因組成及其調(diào)控機制[J]. 微生物學(xué)雜志，2001，21(3)：48-53.